1 方法來源
FDA/BAM Chapter 9 Vibrio2004
2 適用範圍
本程序規定了食品中創傷弧菌（Vibrio vulnificus）的檢驗方法。本程序適用於食品中創傷弧菌的檢驗。
3 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下。
3.1 恒溫培養箱：36℃±1℃、39.5℃±0.5℃。
3.2 冰箱：2℃～5℃、7℃～10℃。
3.3 恒溫水浴箱：36℃±1℃。
3.4 均質器或無菌乳缽。
3.5 天平：感量0.1 g。
3.6 無菌試管：18 mm×180mm、15mm×100mm。
3.7 無菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸頭。
3.8 無菌錐形瓶：容量250mL、500 mL、1000mL。
3.9 無菌培養皿：直徑90mm。
3.10 無菌手術剪、鑷子。
3.11 PCR儀。
3.12 電泳裝置。
3.13 凝膠分析成像係統。
3.14 PCR超淨工作台。
3.15 高速台式離心機（15000r/min）。
3.16 微量可調移液器（2μL、10μL、100μL、1000μL）和相應吸頭。
4 培養基和試劑
4.1 3％氯化鈉堿性蛋白腖水：見附錄A中A.1。
4.2 改良纖維二糖-多粘菌素B-多粘菌素E（mCPC）瓊脂：見附錄A中A.2。
4.3 纖維二糖-多粘菌素E（CC）瓊脂：見附錄A中A.3。
4.4 3％氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂：見附錄A中A.4。
4.5 3％氯化鈉三糖鐵瓊脂：見附錄A中A.5。
4.6 嗜鹽性試驗培養基：見附錄A中A.6。
4.7 3％氯化鈉賴氨酸脫羧酶試驗培養基：見附錄A中A.7。
4.8 3％氯化鈉MR-VP培養基：見附錄A中A.8。
4.9 3％氯化鈉溶液：見附錄A中A.9。
4.10 氧化酶試劑：見附錄A中A.10。
4.11 革蘭氏染色液：見附錄A中A.11。
4.12 鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）試劑：見附錄A中A.12。
4.13 Voges-Proskauer（V-P）試劑：見附錄A中A.13。
4.14 生化鑒定試劑盒。
4.15 DNA提取液。
4.16 6×上樣緩衝液。
4.17 0.5×TBE。
4.18 瓊脂糖。
4.19 DNA分子量標記物（100 bp-1000 bp）。
4.20 PCR反應配套試劑。
第一法 定性檢驗
5 檢驗程序
創傷弧菌檢驗程序見圖1。
6 操作步驟
6.1 樣品製備
6.1.1 非冷凍樣品采集後應立即置7℃～10℃冰箱保存，盡可能及早檢驗；冷凍樣品應在45 ℃以下不超過15min或在2 ℃～5 ℃不超過18 h解凍。
6.1.2 魚類和頭足類動物取表麵組織、腸或鰓。貝類取全部內容物，包括貝肉和體液；甲殼類取整個動物，或者動物的中心部分，包括腸和鰓。如為帶殼貝類或甲殼類，則應先在自來水中洗刷外殼並甩幹表麵水分，然後以無菌操作打開外殼，按上述要求取相應部分。
6.1.3 以無菌操作取樣品25g（mL），加入3％氯化鈉堿性蛋白腖水225mL，用旋轉刀片式均質器以8000r/min～10000r/min均質1min～2min，或拍擊式均質器拍擊1min～2min，製備成1:10的樣品勻液。如無均質器，則將樣品放入無菌乳缽，自225mL3％氯化鈉堿性蛋白腖水中取少量稀釋液加入無菌乳缽，樣品磨碎後放入500mL無菌錐形瓶，再用少量稀釋液衝洗乳缽中的殘留樣品1～2次，洗液放入錐形瓶，最後將剩餘稀釋液全部放入錐形瓶，充分振蕩，製備1:10的樣品勻液。
6.2 增菌
將上述1:10樣品勻液於36℃±1℃培養18 h～24 h。
6.3 分離
6.3.1 對所有顯示生長的增菌液，用接種環在距離液麵以下1cm內沾取一環增菌液，於mCPC或CC平板上劃線分離。於39℃～40 ℃過夜培養（如果達不到39 ℃～40 ℃，則35 ℃～37 ℃）。
6.3.2 典型的創傷弧菌在mCPC和CC平板上呈現為圓的、扁平的、中心不透明邊緣透明的黃色菌落，直徑1 mm～2 mm。
6.4 純培養
挑取3個或以上可疑菌落，劃線接種3％氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養18 h～24 h。
6.5 初步鑒定
6.5.1 氧化酶試驗：挑選純培養的單個菌落進行氧化酶試驗，創傷弧菌為氧化酶陽性。
6.5.2 塗片鏡檢：將可疑菌落塗片，進行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態。創傷弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態，無芽胞，有鞭毛。
6.5.3 挑取純培養的單個可疑菌落，轉種3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵並穿刺底層，36℃±1℃培養24 h觀察結果。創傷弧菌在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂中的反應為底層變黃不變黑，無氣泡，斜麵顏色不變或紅色加深，偶爾斜麵變黃。
6.5.4 嗜鹽性試驗：挑取純培養的單個可疑菌落，分別接種0%、6%、8%和10%不同氯化鈉濃度的胰腖水，36℃±1 ℃培養24 h，觀察液體混濁情況。創傷弧菌在無氯化鈉、8％氯化鈉和10%氯化鈉的胰腖水中不生長或微弱生長，在6%氯化鈉的胰腖水中生長旺盛。
6.6 確證鑒定
取純培養物分別接種含3%氯化鈉的賴氨酸脫羧酶試驗培養基、MR-VP培養基，36℃±1℃培養24 h～48 h後觀察結果；3%氯化鈉三糖鐵瓊脂隔夜培養物進行ONPG試驗。可選擇生化鑒定試劑盒。創傷弧菌的生化性狀見表1，創傷弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別見表2。
表1 創傷弧菌的生化性狀
|
試驗項目 |
結果 |
|
革蘭氏染色鏡檢 |
陰性，棒狀或弧狀 |
|
氧化酶 |
＋ |
|
動力 |
＋ |
|
D-纖維二糖 |
＋ |
|
蔗糖 |
－ |
|
葡萄糖 |
＋ |
|
分解葡萄糖產氣 |
－ |
|
乳糖 |
＋ |
|
硫化氫 |
－ |
|
賴氨酸脫羧酶 |
＋ |
|
V-P |
－ |
|
ONPG |
＋ |
|
注：＋陽性；－陰性。 |
|
表2 創傷弧菌主要性狀與其他弧菌的鑒別
|
名稱 |
氧 化 酶 |
賴 氨 酸 |
精 氨 酸 |
鳥 氨 酸 |
明 膠 |
脲 酶 |
V ︱ P |
42 ℃ 生 長 |
蔗 糖 |
D ︱ 纖 維 二 糖 |
乳 糖 |
阿 拉 伯 糖 |
D ︱ 甘 露 糖 |
D ︱ 甘 露 醇 |
ONPG |
嗜鹽性試驗 NaCl含量（％） |
||||
|
0 |
3 |
6 |
8 |
10 |
||||||||||||||||
|
創傷弧菌 |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
V |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
|
副溶血性弧菌 V. parahaemolyticus |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
＋ |
－ |
V |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
|
溶藻弧菌 V. alginolyticus |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
|
霍亂弧菌 V.cholerae |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
V |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
擬態弧菌 V.mimicus |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
河弧菌 V. fluvialis |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
V |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
|
弗氏弧菌 V.furnissii |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
|
梅氏弧菌 V. metschnikovii |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
＋ |
V |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
V |
－ |
|
霍利斯弧菌 V. hollisae |
＋ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
nd |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
|
嗜水氣單胞菌 A.hydrophilia |
＋ |
V |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
V |
V |
＋ |
V |
V |
V |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
|
類誌賀鄰單胞菌 |
＋ |
＋ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
－ |
－ |
| 注：nd 表示未試驗；V 表示可變。 | ||||||||||||||||||||
6.7 PCR鑒定（選做）
6.7.1 DNA模板的製備
取可疑的純菌落加入500 μL滅菌dH2O中混勻煮沸10 min，15000×g離心3 min。取上清液儲存在-20℃直至使用。也可以用商業化的DNA提取試劑盒並按其說明提取製備DNA模板。
6.7.2 PCR擴增
6.7.2.1 引物
|
Vvh-785F |
5' ccg cgg tac agg ttg gcg ca 3' |
|
Vvh-1303R |
5' cgc cac cca ctt tcg ggc c 3' |
擴增片段長度：519 bp
6.7.2.2 陰性對照、陽性對照設置
陰性對照(空白對照)以滅菌水作為PCR反應的模板；
陽性對照采用含有檢測序列的DNA（或質粒）作為PCR反應的模板。
6.7.2.3 PCR反應體係
|
試劑 |
反應體積 |
|
dH2O |
28.2 μL |
|
10× Buffer. MgCl2 |
5.0 μL |
|
dNTPs |
8.0 μL |
|
引物 |
7.5 μL |
|
模板 |
1.0 μL |
|
Taq酶 |
0.3 μL |
|
總體積 |
50.0 μL |
6.7.2.4 PCR反應程序
|
預變性 |
94℃ |
10 min； |
|
變性 |
94℃ |
1 min， |
|
退火 |
62℃ |
1 min， |
|
延伸 |
72℃ |
1 min，25個循環； |
|
終延伸 |
72℃ |
10 min； |
|
保存 |
8℃ |
—— |
6.7.2.5 電泳
用0.5×TBE製備1.5％的瓊脂糖凝膠（含EB或Goldview0.5μg /mL，）。各取5 μl PCR產物點樣（可包括適量上樣緩衝液），用DNA分子量標記物做參照，電壓100 V，電泳50 min（根據實驗室儀器情況確定具體電泳條件）。使用凝膠成像係統對電泳結果進行保存和分析。
6.8 結果判定
陰性對照未出現條帶，陽性對照出現預期大小的擴增條帶條件下，如待測樣品未出現519 bp大小的擴增條帶，則可判定該樣品檢驗結果為陰性；如待測樣品出現519 bp大小的擴增條帶，則可判定該樣品檢驗結果為陽性。
如果陰性對照出現條帶和/或陽性對照未出現預期大小的擴增條帶，本次待測樣品的結果無效，應重新進行試驗，並排除汙染因素。
6.9 報告
根據生化或PCR結果，報告25 g（mL）樣品中檢出或未檢出創傷弧菌。
第二法 MPN計數法
7 操作步驟
7.1 樣品製備
同6.1。
7.2 增菌
7.2.1 用滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1 mL，注入含有9 mL 3％氯化鈉堿性蛋白腖水的試管內，振搖試管混勻，製備1:100的樣品勻液。
7.2.2 另取1 mL滅菌吸管，按6.2.2.1操作程序，依次製備10倍係列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋一次，換用一支1 mL無菌吸管。
7.2.3 根據對檢樣汙染情況的估計，選擇3個適宜的連續稀釋度，每個稀釋度接種3支含有9mL3％氯化鈉堿性蛋白腖水的試管，每管接種1mL。置36℃±1℃恒溫箱內，培養18 h～24 h。
7.3 分離鑒定
同定性檢測。
8 結果與報告
根據證實為創傷弧菌陽性的試管管數，查最可能數（MPN）檢索表，報告每g（mL）創傷弧菌的MPN值。
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