1 方法來源
GB 4789.9-2014《中華人民共和國國家標準食品微生物學檢驗 空腸彎曲菌檢驗》，定量檢測方法和PCR鑒定方法來源於2013年衛生部食品安全優先評估項目《雞肉中彎曲菌定量評估》和相關文獻。
2 適用範圍
本程序規定了食品中彎曲菌[空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)、結腸彎曲菌(Campylobactercoli)、海鷗彎曲菌(Campylobacter lari)、烏普薩拉彎曲菌(Campylobacterupsaliensis)和胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus）]的檢驗方法。
本程序適用於生禽肉和生畜肉中彎曲菌的檢驗。
3 設備和材料
除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
3.1 冰箱：2℃～8℃，-20 ℃，-80 ℃。
3.2 恒溫振蕩培養箱：42℃±1℃。25℃±1℃
3.3 水浴裝置：36℃±1℃，100℃±1℃。
3.4 微需氧培養裝置：能夠提供微需氧條件（5%O2、10%CO2和85%N2），如三氣培養箱、使用產氣劑的厭氧罐/袋或其它可代用的裝置等。
3.5 電子天平：感量0.01g。
3.6 無菌均質袋。
3.7 顯微鏡：10×～100×，有相差功能。
3.8 離心機：離心力≥ 20000×g。
3.9 全自動微生物鑒定係統。
3.10 漩渦混勻儀。
3.11 基因擴增儀。
3.12 電泳儀。
3.13 凝膠成像係統。
3.14 具塞試劑瓶（或三角瓶）：500mL，1000mL；玻璃試管：15mL；L玻璃棒。
3.15 無菌槍頭：10μL,200μL, 1000μL。
3.16 無菌EP管：1.5mL；無菌凍存管：2mL。
3.17 孔徑0.45μm～0.6μm，直徑47mm左右的無菌濾膜。
4 培養基和試劑
4.1 Preston肉湯：見附錄A中A.1。
4.2 緩衝蛋白腖水（BPW）：見附錄A中A.2。
4.3 mCCD瓊脂：見附錄A中A.3。
4.4 Skirrow瓊脂：見附錄A中A.4。
4.5 Karmali瓊脂：見附錄A中A.5。
4.6 Preston瓊脂：見附錄A中A.6。
4.7 哥倫比亞瓊脂：見附錄A中A.7。
4.8 布氏肉湯：見附錄A中A.8。
4.9 氧化酶試劑：見附錄A中A.9。
4.10 馬尿酸鈉水解的檢測試劑：見附錄A中A.10。
4.11 吲哚乙酸酯紙片：見附錄A中A.11。
4.12 彎曲菌保存培養基：見附錄A中A.12。
4.13 彎曲菌運輸半固體培養基：見附錄A中A.13。
4.14 1mol/LNaOH溶液。
4.15 3%過氧化氫溶液。
4.16 生化鑒定試劑盒。
4.17 全自動微生物鑒定係統生化鑒定卡。
4.18 彎曲菌PCR檢測試劑。
4.19 Tris-乙酸（TAE）、瓊脂糖、LoadingBuffer、溴化乙錠（EB）。
4.20 超純水。
4.21 無菌脫纖維羊血。
4.22 抗生素：頭孢呱酮、多粘菌素B硫酸鹽、利福平、兩性黴素B、萬古黴素、甲氧苄啶。
第一法 定性檢驗
5 檢驗程序
檢驗程序見圖1。
6 操作步驟
6.1 樣品處理
禽胴體：無菌條件下，將禽胴體放入合適容積的無菌自封袋中，加入Preston肉湯淹沒樣品（按每1kg樣品加入500mL Preston肉湯的比例），置於振蕩器上，5采集的樣品最好現場接種；如不能實現應將樣品低溫保存（4-7℃），但避免直接接觸冰塊。樣品應盡快送達實驗室檢測，以避免彎曲菌的損傷/死亡。以100 r/min的速度震蕩15 min，或反複揉搓禽胴體5 min（注意各個部位均要揉到）。無菌操作取出禽胴體，漂洗液進行檢測。如果同時做多個檢驗項目，可以從禽胴體不同部位（脖子、胸、腿和肛門）處剪取檢驗需要量的肉和皮，均質2 min，取該混合樣進行其他項目的檢驗，剩餘的禽胴體依照上法用Preston肉湯漂洗後取漂洗液進行彎曲菌檢驗。
分割禽肉或畜肉：取分割肉1塊（大於100g）放入無菌自封袋中，加入適量Preston肉湯淹沒樣品（按每1kg樣品加入500 mLPreston肉湯的比例），以100r/min的速度震蕩15min,無菌操作取出肉塊，漂洗液進行檢測。如果同時做多個檢驗項目，可以將多塊分割肉塊一起揉搓，剪取檢驗需要量進行其他項目的檢驗，剩餘的分割肉（大於100g）依照上法用Preston肉湯漂洗後取漂洗液進行彎曲菌檢驗。
6.2 增菌
6.2.1 微需氧環境的建立：
抽氣換氣法（含有5%O2、10%CO2和85%N2的混合氣體）：將無菌吸管一端連接混合氣體鋼瓶，另一端插入含有樣品漂洗液的無菌自封袋中，密封袋口，打開混合氣體鋼瓶開關充氣至無菌袋鼓起，輕輕晃動，使袋內的液體與混合氣體充分接觸，然後停止充氣，雙手按壓排出袋內混合氣體。以此法充氣排氣3次後再充入混合氣體，拔出吸管，立即密封袋口。
微需氧產氣袋法：將漂洗液倒入無菌瓶子內（將瓶子的蓋子旋鬆或以無菌牛皮紙包紮瓶口，以利於氣體的交換），將瓶子放入適當容積的微需氧培養裝置（厭氧盒裏放置微需氧產氣袋，注意微需氧產氣袋產生氣體的量一定和厭氧盒子的容積相當）。
三氣培養箱等儀器法：按儀器說明書調節溫度和氣體含量，待穩定後，放入含有漂洗液的瓶子（將瓶子的蓋子旋鬆或以無菌牛皮紙包紮瓶口，以利於氣體的交換）。
6.2.2 在微需氧條件下，42℃±1℃震蕩（25～100r/min）或靜止培養24h±2h。
6.3 分離培養
6.3.1 增菌液接種
將Karmali或mCCD瓊脂平板和Preston或Skirrow瓊脂平板在42℃±1℃烘幹表麵水分，將0.45μm~0.6μm無菌濾膜輕輕貼在平板的中間，不要產生空隙；取24h增菌液200μL~250μL滴加在濾膜上，室溫靜置45min~60min，待液體全部透過濾膜後，用無菌鑷子將濾膜輕輕揭下，棄去，翻轉平板，微需氧條件下42℃±1℃培養48 h±2 h。
6.3.2 可疑菌落的篩選
彎曲菌屬在Karmali選擇性平板上典型菌落形態一般有兩種，一種呈淺灰或灰白色、半透明而中心顏色較暗，圓形，光滑，中間凸起、針尖狀或小水珠狀， 直徑1mm～3mm，邊緣整齊、有光澤的單個菌落；另一種呈淺灰白色、半透明、扁平或稍突起、水滴狀，形狀常呈不規則圓盤狀，直徑2 mm～5mm的單個菌落。禽漂洗液中以第一種菌落形態較為常見。
mCCD瓊脂平板上的可疑菌落通常有光澤、潮濕、扁平，呈擴散生長的傾向，直徑約為1mm～2 mm。
Skirrow瓊脂平板上的第一型可疑菌落為灰色、扁平、濕潤有光澤，呈沿接種線向外擴散的傾向；第二型可疑菌落常呈分散凸起的單個菌落，直徑約為1 mm～2 mm，邊緣整齊、發亮。禽漂洗液中以第一種菌落形態較為常見。
Preston瓊脂平板上的典型菌落形態一般也有兩種，一種呈淺灰白色或略顯淺粉白色，半透明、扁平或稍突起、濕潤、水滴狀，直徑2 mm～9mm不等的單個菌落；另一種呈淺灰色、半透明、圓形、光滑、隆起，針尖狀或小水珠狀，直徑1 mm～3mm，邊緣整齊、有光澤的單個菌落。兩種菌落形態均常見。
經過濾膜過濾培養後，一般平板上菌落都是純的彎曲菌菌落。
6.4 鑒定
6.4.1 彎曲菌屬的鑒定
挑取可疑菌落2～3個接種到哥倫比亞瓊脂平板上，微需氧條件下42℃培養24 h±2 h，按照6.4.1.1~6.4.1.5進行鑒定，結果符合表1的可疑菌落確定為彎曲菌屬。
表1 彎曲菌屬的鑒定
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項目 |
彎曲菌屬特性 |
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形態觀察 |
革蘭氏陰性，菌體彎曲如小逗點狀，兩菌體的末 端相接時呈S形、螺旋狀或海鷗展翅狀a |
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動力觀察 |
呈現螺旋狀運動b |
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氧化酶試驗 |
陽性 |
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微需氧條件下25 ℃±1 ℃生長試驗 |
不生長 |
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有氧條件下42 ℃±1 ℃生長試驗 |
不生長 |
|
a有些菌株的形態不典型。 |
|
6.4.1.1 形態觀察
對可疑菌落進行革蘭氏染色，複染時使用0.5%的苯酚品紅溶液。彎曲菌為革蘭氏陰性，菌體彎曲如小逗點狀，兩菌體的末端相接時呈S形、螺旋狀或海鷗展翅狀。
6.4.1.2 動力觀察
挑取可疑菌落用1mL布氏肉湯懸浮，用相差顯微鏡觀察運動狀態。彎曲菌屬呈現螺旋狀運動。
6.4.1.3 氧化酶試驗
使用無菌棉簽蘸取可疑菌落，將氧化酶試劑直接滴加到沾有菌的棉簽上，如果在10 s內出現紫紅色、紫羅蘭或深藍色為陽性。彎曲菌屬為陽性。
6.4.1.4 微需氧條件下25℃±1℃生長試驗
挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，微需氧條件下25℃±1℃培養44 h±4 h，觀察細菌生長情況。彎曲菌屬不生長。
6.4.1.5 有氧條件下42℃±1℃生長試驗
挑取可疑菌落，接種到哥倫比亞血瓊脂平板上，有氧條件下42 ℃±1℃培養44 h±4 h，觀察細菌生長情況。彎曲菌屬不生長。
6.4.2 空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌的鑒定
6.4.2.1 過氧化氫酶試驗
挑取菌落，加到幹淨玻片上的3％過氧化氫溶液中，如果在30 s內出現氣泡則判定結果為陽性。空腸彎曲菌、結腸彎曲菌和海鷗彎曲菌為陽性。
6.4.2.2 馬尿酸鹽水解試驗
挑取菌落（菌量要大），加到盛有0.4 mL 1％馬尿酸鈉的試管中製成菌懸液。
混合均勻後在36℃±1℃水浴中溫育2 h或36℃±1℃培養箱中溫育4 h。加入
0.2 mL茚三酮溶液，在36℃±1℃的水浴或培養箱中再溫育10 min後判讀結果。若出現深紫色則為陽性；若出現淡紫色或沒有顏色變化則為陰性。
6.4.2.3 吲哚乙酸酯水解試驗6
挑取菌落（菌量要大）至羥基吲哚醋酸鹽紙片上，再滴加一滴滅菌蒸餾水。如果吲哚乙酸脂水解，則在5 min～10 min內出現深藍色；若無顏色變化則表示沒有發生水解。空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌的鑒定結果見表2。
表2 空腸彎曲菌、結腸彎曲菌、海鷗彎曲菌和烏普薩拉彎曲菌的鑒定
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特征 |
空腸彎曲菌 （C.jejuni） |
結腸彎曲菌 （C.coli） |
海鷗彎曲菌 （C.lari） |
烏普薩拉彎曲菌 （C.upsaliensis） |
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過氧化氫酶試驗 |
＋ |
＋ |
＋ |
－或微弱 |
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馬尿酸鹽水解試驗 |
＋ |
－ |
－ |
－ |
|
吲哚乙酸脂水解試驗 |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
6.4.2.4 替代實驗
對於確定為彎曲菌屬的菌落，可以使用生化鑒定試劑盒或全自動微生物鑒定係統來替代6.4.2.1～6.4.2.3的鑒定。
6.4.3 彎曲菌的PCR鑒定（可選項目）
按下列方法進行PCR鑒定。也可以使用商品化的試劑盒對可疑彎曲菌純培養物進行鑒定，試劑盒使用前需經過驗證合格，具體操作見產品說明書。
6.4.3.1 模板DNA的製備
無菌接種環挑取少量菌苔，在200μL無菌超純水中混勻（菌懸液呈肉眼可見的微混濁狀即可，不宜過度混濁），於100℃水浴中加熱10 min後，13000×g離心2min，上清液即為製備好的DNA模板，將其轉於另一無菌離心管中備用。
6.4.3.2 引物序列和目的基因片段見表3。
表3 五種彎曲菌特征基因序列和PCR片段大小
|
檢測基因 |
引物序列 |
片段大小/bp |
|
23S rRNA (彎曲菌) |
23S-F: 5’-TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG-3’ 23S-R: 5’-ATCAATTAACCTTCGAGCACCG-3’ |
650 |
|
hipO |
CJ-F: 5’-ACTTCTTTATTGCTTGCTGC-3’ |
323 |
|
glyA |
CC-F: 5’-GTAAAACCAAAGCTTATCGTG-3’ |
126 |
|
glyA |
CL-F: 5’-TAGAGAGATAGCAAAAGAGA-3’ |
251 |
|
glyA |
CU-F: 5’-AATTGAAACTCTTGCTATCC-3’ |
204 |
|
sapA12 |
CF-F: 5’-GCAAATATAAATGTAAGCGG-3’ |
435 |
6.4.3.3 反應體係見表4。
表4 PCR反應體係組成
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試劑 |
使用量 |
|
10×Buffer |
2.5μL |
|
MgCl2 |
20 mM |
|
KCl |
100 mM |
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[NH4]2SO4 |
50mM |
|
dNTPs |
200 μM |
|
23S-F |
0.2 μM |
|
23S-R |
0.2 μM |
|
CJ-F |
0.5 μM |
|
CJ-R |
0.5 μM |
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CC-F |
1 μM |
|
CC-R |
1 μM |
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CL-F |
0.5 μM |
|
CL-R |
0.5 μM |
|
CU-F |
0.5 μM |
|
CU-R |
0.5 μM |
|
CF-F |
0.5 μM |
|
CF-R |
0.5 μM |
|
Taq酶 |
1.25 U |
|
DNA |
2.5μL |
|
總體積 |
補充超純水至25μL |
6.4.3.4 PCR反應條件
95℃預變性6 min後，按照95℃30s，59℃30s，72℃30 s進行30個
循環，然後72℃延伸7 min。產物當時不能檢測時4℃保存。
6.4.3.5 PCR檢測
分別取10 μL PCR產物，與2 μL 6×loading buffer混勻後，加樣於點樣孔中。5 v/cm，電泳30 min～40 min。與對照相比，若出現目的條帶則為陽性。
7 結果報告
綜合以上試驗結果，報告樣品中檢出空腸彎曲菌或/和結腸彎曲菌或/和海鷗彎曲菌或/和烏普薩拉彎曲菌或/和胎兒彎曲菌。
如果沒有可疑菌落、或可疑菌落鑒定後不是空腸彎曲菌或/和結腸彎曲菌或/和海鷗彎曲菌或/和烏普薩拉彎曲菌者或/和胎兒彎曲菌，報告樣品中未檢出空腸彎曲菌或/和結腸彎曲菌或/和海鷗彎曲菌或/和烏普薩拉彎曲菌或/和胎兒彎曲菌。
第二法 平板計數法
8 檢驗程序
彎曲菌平板計數程序見圖2：
9 操作步驟樣品處理
9.1.1 禽胴體：無菌條件下，將禽胴體放入合適容積的無菌自封袋中，加入緩衝蛋白腖水（以每1kg樣品加入500mL緩衝蛋白腖水的比例），置於振蕩器上，以100r/min的速度震蕩15min，或反複揉搓禽胴體5 min（注意各個部位均要揉到）。無菌操作取出禽胴體，漂洗液作為原液進行檢測。如果同時做多個檢驗項目，可以從禽胴體不同部位（脖子、胸、腿和肛門）處剪取檢驗需要量的肉和皮，均質2 min，取該混合樣進行其他項目的檢驗，剩餘的禽胴體依照上法用緩衝蛋白腖水漂洗後取漂洗液作為原液進行彎曲菌檢測。
9.1.2 分割的肉塊：取分割肉適量放入無菌自封袋中，加入緩衝蛋白腖水（以每1kg樣品加入500 mL緩衝蛋白腖水的比例），以100 r/min的速度震蕩15 min,無菌操作取出肉塊，漂洗液作為原液進行檢測。如果同時做多個檢驗項目，可以將多塊分割肉塊一起揉搓，從不同肉塊上剪取檢驗需要量進行其他項目的檢測，剩餘的分割肉依照上法用緩衝蛋白腖水漂洗後，取漂洗液作為原液進行彎曲菌檢測。
9.1.3 用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取9.1.1或9.1.2漂洗液，沿管壁緩慢注於盛有9mL稀釋液（生理鹽水或pH7.2磷酸鹽緩衝液）的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反複吹打使其混合均勻，製成1:100的樣品勻液。
9.1.4 按9.1.3操作程序，製備10倍係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1 mL無菌吸管或吸頭。
9.2 樣品的接種和培養
根據對樣品汙染狀況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液（一般選擇原液、10倍、100倍或1000倍稀釋液），每個稀釋度各100μL，立即塗布於Karmali選擇性瓊脂平板上，每個稀釋度每種平板做2個平行，於42℃±1℃微需氧環境（5%O2、10%CO2、85%N2）培養48 h±2 h。
9.3 可疑彎曲菌菌落形態
彎曲菌屬在Karmali選擇性平板上典型菌落形態一般有兩種，一種呈淺灰或灰白色、半透明而中心顏色較暗，圓形，光滑，中間凸起、針尖狀或小水珠狀，直徑13mm；邊緣整齊、有光澤的單個菌落；另一種呈淺灰白色、半透明、扁平或稍突起、水滴狀，形狀常呈不規則圓盤狀，直徑2 mm～5 mm的單個菌落。雞漂洗液中以第一種菌落形態較為常見。
9.4 菌落計數
9.4.1 若Karmali平板上未出現符合上述特征的可疑菌落，則樣品中彎曲菌為陰性。
9.4.2 培養後，觀察平板上出現的所有可疑菌落數，菌落形態通常為單一類別，有時候可能出現多種菌落形態。選擇平均可疑菌落數15-150CFU/板的稀釋度進行計數。
9.4.3 如果所有稀釋度的平板上的平均可疑菌落數均不在15-150CFU/板範圍內，其中一部分小於15CFU或大於150CFU，則選擇平均可疑菌落數最接近15或150的稀釋度，且菌落分離度好的平板進行計數。
9.4.4 如果所有稀釋度平板可疑菌落數均>150CFU/板，則選擇稀釋倍數最大、菌落分離度好的平板進行計數。
9.5 彎曲菌純化
9.5.1 用接種針從平均可疑菌落數15-150CFU/板的同一稀釋度的兩塊平板上共挑取至少5個可疑菌落（可疑菌落總數不足5個時，全部挑取），劃線接種於哥倫比亞血瓊脂平板上，於42℃±1℃微需氧環境中培養48h±2h。
9.5.2 如果最高稀釋度平板上的可疑彎曲菌平均菌落數>50CFU/板，則從該稀釋度中挑取用於鑒定的菌落數應為平均菌落數的10%（最多10個菌落）。
9.5.3 如果同一種類型的菌落鑒定結果不一致（如菌落表型特征一樣但鑒定結果不同），再多挑幾個該種類型的菌落（總數可達到10個）進行純化。
9.6 可疑彎曲菌菌落的鑒定
使用生化鑒定或PCR方法對可疑彎曲菌菌落進行鑒定，具體操作見6.4鑒定。
9.7 菌落計數和結果計算
依據生化鑒定或PCR鑒定結果，計算每塊選擇性平板上彎曲菌的實際菌落數。
計算公式如下：
每塊平板上彎曲菌實際菌落數=兩塊平板上可疑菌落數的平均數×（鑒定為彎曲菌的陽性菌落數/挑取的可疑菌落數）
例如：同一稀釋度的兩塊Karmali平板上分別有100CFU和85CFU可疑菌落，挑取5個可疑菌落進行鑒定後，結果顯示4個菌落為彎曲菌，則陽性率為80%，則該稀釋度下彎曲菌的實際菌落數為：（100+85）/2′80%=74CFU。根據稀釋度和接種量計算每克樣品中的彎曲菌數量：如10-1稀釋度平板上彎曲菌平均菌落數為74CFU，則彎曲菌數量（CFU/g）= 74′10′（1/0.1）′（500/1000）注：74：10-1稀釋度平板上彎曲菌平均菌落數為74；10：稀釋倍數（10-1稀釋度）；0.1：每平板上塗布樣液量0.1mL（100μL）； 500/1000：500mL緩衝蛋白腖水/樣品重量1 kg。
10 報告
根據9.7計算結果，報告每g樣品中某種彎曲菌或幾種彎曲菌的數量（小於100CFU，按“四舍五入”原則修約後以整數報告；大於或等於100CFU，以10的指數形式來表示，保留2位有效數字），以CFU/g為單位報告；如果平板上均無可疑菌落，則以小於1乘以最低稀釋倍數乘以5報告。
11 菌株的保存和運輸
11.1 菌株保存
將經過鑒定的菌株純化於哥倫比亞瓊脂平板上，42 ℃±1 ℃微需氧環境中培養18 h～24 h後，無菌棉拭子將哥倫比亞瓊脂平板上的所有菌苔全部擦拭後，均勻懸浮於盛有彎曲菌保存培養基的凍存管中於4℃冰箱放置30 min，然後貯於-80℃凍存。
11.2 菌株運輸
運送前，將凍存管從-80℃冰箱中取出，用接種環挑取少許凍存液，劃線接種於1塊哥倫比亞瓊脂平板上，42℃±1℃微需氧環境中培養48 h後，用無菌接種環將所有菌苔全部刮下，轉種於含5%裂解羊血的彎曲菌運輸半固體培養基中，擰緊管蓋後，置於裝有冰塊的保溫裝置中，運輸時間不宜超過48 h。
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