(一)菌體收集和DNA提取
同“DNA的G+C含量測定”部分。
(二)DNA/DNA同源性測定方法
現介紹應用較多的兩種:
1.複性率方法:
(1)DNA樣品處理：用溶菌酶或SDS等破壁提取的DNA絲狀溶解物，實驗前需先置冰浴中用超聲波50 W超聲4次，每次15 s,間隔1-2min,使DNA片段在2～5 x 105dalton;用超聲破壁提取的DNA溶液,不再做超聲處理。
(2)DNA變性：將剪切過的待測DNA樣品(A、B)分別用O.lSSC精確配製成OD260為1.5或2.0（約50 μg/0D)；取樣品A、B各3 ml分別裝在兩支中試管裏，再取A,B各1.5ml裝在同一支試管中混勻為樣品M。A、B、M三個樣品測試前分別置沸水浴中變性10 min,用預熱的1 ml吸管吸預熱的lOSSC O72 ml加入上述變性樣品中，稍加混勻,使最終濃度為2SSC。
(3)測定DNA的複性速率：①開機和選擇測量條件，打開分光光度計，待儀器校正後，選擇時間掃描，固定260 nm波長，選擇3 mm/min的掃描 速度自動控製時間，並使記錄紙上的量程放大2-2.5倍。②預熱比色架和比色杯（裝有2SSC)。用半導體點溫計通過熱敏電阻探頭監視杯中溶液的溫度，使其穩定在指定的最適複性溫度（TOR）。③上樣：待達到TOR後，棄去比色杯中的2SSC溶液，迅速轉入變性DNA樣品液，同時接通熱敏電阻，觀察溫度。全部過程不得使樣品的溫度低千TOR。④測定複性率：待測試樣品的溫度達到TOR時，開始記錄相應的吸光度，以此為零時，隨後每隔5 min讀數一次，待反應進行到30 min時，停止掃描。最終得到一條隨時間延長、吸光值逐漸減小的直線。⑤計算複性速率：用零時的吸光度減去30 min時的吸光度，除以總時間(30 min)，得出直線的斜率， 即DNA的複性速率（通常用V表示單位為每分鍾吸光值的減少值）。 每個樣品需重複測試2～3次。計算：
0min～30min的吸收值/30min=V（複性率）
4Vm-（Va-Vb）/2√VaVb X 100
Va、Vb和Vm分別表示A、B樣品和M為混合樣品的複性速率。
2.固相分子雜交方法
（1）製膜：取0.2 mlDNA溶液（含量約為10 μg/0D)，加入蒸溜水至2.5 ml,於lOO℃變性10 min,轉入冰浴，加入預冷的12 X SSC 2.5 ml,減壓慢速濾過微孔膜(GSWP,孔徑0.22 μm,膜徑為25 mm,用前在蒸餾水和6XSSC中分別浸泡半小時），再以25 ml 6 x SSC抽濾洗膜（收集DNA的濾液，測其OD260,與濾前相比較，可求得吸附率），濾膜於室溫過夜，然後以不鏽鋼打孔器刻得6 mm直徑的小膜，於80℃烘幹4 h,最後放入真空幹燥器內，4℃保存備用。
（2）標記：取100 μg變性DNA溶液於0.1 mol/LNaAc-0.04 mol/LHAc (pH 5.0)溶液中，置冰浴，並依次加入KI (2.5 m mol/L水溶液），使終濃度為0.25 m mol/L；加Na125I 200-400 μCi混合，最後加入三氯化駝（6.5 X 10-2mol/LTiCl3水溶液），使其終濃度為6.5 X 10-3mol/L。總的反應體積為0.3-0.ml。混合物在60℃水浴中保溫20 min,冷卻加入新配製的0.1 mol/L NH4Ac-0.5 mol/LN比OH調pH至8.7, 60℃保溫20 min,冷卻。上Sephadex G50柱(32 x 1.5 cm)，以重蒸餾水洗脫，並收集6～7管(2-3 ml／管）。每管取IOμl滴於小濾紙片，幹燥，投入盛5 ml液閃液[0.4% 2, 5－二苯惡唑，0.01%1, 4－雙（苯基惡唑基-2)－苯的甲苯液］的測量瓶內，以NE 8312液閃測量儀測量放射性強度，同時用紫外分光光度計測量每管的OD260。其中皆高者為己標上125I的DNA溶液，置冰箱保存備用。
（3）雜交：將6張載有變性DNA的小膜和1張對照的空白小膜一同置於瓶（直徑3 cm,高4.5 cm)內，加入2 ml Denhardt預溫液(3XSSC中含有0.02％菲可，0.02%聚乙烯吡咯烷酮和0.02％牛血清白蛋白）， 加塞置37℃處理5 min,然後吸出預溫液。加入經4號針頭(2 ml針管）反複壓擠剪切15-20次的125I-DNA液，含標記DNA約3 μg，加入12SSC和2% SDS,使總反應體積約1 ml。 反應液的SSC的終濃度為2XSSC, SDS的濃度為0.1%。 塞緊塞子，置60℃水浴中反應15h,吸出反應液，用2XSSC在60℃下洗膜3次，幹燥小膜，加5 ml液閃液，置液閃儀測置其放射性。
（4）同源性百分數計算：以參考菌株標記的DNA與自身未標記的DNA雜交膜（簡稱同源膜）所測得脈衝數減去空白膜脈衝數，與參考菌株標記的DNA和測定菌株未標記的DNA雜交膜（簡稱異源膜）脈衝數也減去空白膜的脈衝數，然後二者相比，得出參考菌株和測定菌株之間的同源性分數。如公式所示：
同源性%=(異源膜脈衝數-對照膜脈衝數)/(同源膜脈衝數-對照脈衝數) X100
本文節選自《常見細菌係統鑒定手冊》第十五章。
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