一、目的要求
1 ．了解相差顯微鏡的基本原理及用途．
2 ．學習並掌握使用相差顯微鏡觀察微生物樣品的基本技術．
二、甚本原理
利用暗視野顯微鏡可以進行活細胞觀察，但是看不清細胞的內部結構而20世紀40 年代出現的相差顯微技術卻使人們不僅能觀察活細胞的形態，而且還能看到細胞的內部結構及其隨時間變化的過程．為此，F.Zernike 獲得了1953 年的諾貝爾物理學獎．
光線通過比較透明的標本時，光的波長（顏色）和振幅（亮度）都沒有明顯的變化．因此，用普通光學顯微鏡觀察未經染色的標本〔 如活的細胞）時，其形態和內部結構往往難以分辨．然而．由於細胞各部分的折射率和厚度的不同，光線通過這種標本時，直射光和衍射光的光程就會有差別。隨著光程的增加或減少，加快或落後的光彼的相位會發生改變（產生相位差）．光的相位差人肉眼感覺不到，但相差顯微鏡能通過其特殊裝置― 環狀光闌和相板，利用光的於涉現象，將光的相位差轉變為人限可以察覺的振幅差（明暗差〕 ，從而使原來透明的物體表現出明顯的明暗差異，對比度增弧，使我們能比較清楚地觀察到在普通光學顯微鏡和暗視野顯微鏡下都看不到或看不清的活細胞及細胞內的某些細菌結構。
相差顯微鏡的成像原理及裝置如圖皿一4 所示．
相差顯微鏡與普通光學顯微鏡在構造上的不同在於用環狀光閡代替可變光閱．用帶相板的相差物鏡代替普通物鏡．及需用合軸調節望遠鏡來校直光軸並使用濾色片．
( l ）環狀光鬧相差顯微鏡的聚光器光闌是環狀光閱，照明光線隻能從環狀的透明區進人聚光鏡再斜射到標本上（斜射角度遠小於暗視野聚光器），產生直射光和繞射光，大小不同的環狀光闌與聚光鏡一起形成轉盤聚光器．其轉盤前端有標示孔，表示位於聚光鏡下麵的光閡種類，不同的光門應與各自不同放大率的物鏡配套使用。
( 2 ）相差物鏡（鏡頭上標有PC 或PH 字樣）物鏡的後焦平麵上裝有相板，這是相差顯微鏡的主要裝裏．相板由與環狀光閡相對應的環狀共扼麵和補償麵‘共扼麵的內外側部分）兩部分組成，分別透過直射光和繞射光．通過塗在相板上的吸收膜和推遲相位膜，直射光和繞射光會發生光強度減弱及相位改變．再通過兩者的幹涉作用，將相位差變為振幅差。如果是部分吸收直射光而推遲繞射光的相位可產生暗反差（形成明亮的背景和暗的標本），反之，如果是部分吸收繞射光而推遲直射光的相位則產生明反差（標本是明亮的而背景是暗的）.
( 3 ）合軸調節望遠鏡由於環狀光闌的光環和相差物鏡中的相位環很小，在合軸調節中必須使用特別的低倍望遠鏡，保證兩環的環孔相互吻合，光軸完全一致.
( 4 ）濾光片 進行相差顯微鏡觀寮時一般都使用綠色濾光片．這是因為相差物鏡多屬消色差物鏡，這種物鏡隻糾正了黃、綠光的球差而未糾正紅藍光的球差，在便用時采用綠色濾光片效果最好，另外，綠色建光片有吸熱作用（吸收紅色光和藍色光），進行活體觀察時比較有利，
三、器材
1 ．菌種釀酒酵母水浸片，枯草芽孢杆菌水浸片．
2 ．儀器或其他用具顯微鏡，相差顯微鏡聚光器，相差物鏡，合軸調節望遠鏡，綠色濾光片，1 . 0mm 以下載玻片，0 . 16 ~ 0 . 17 mm以下蓋玻片等．
四，操作步驟
1 ．將顯微鏡的聚光器和接物鏡換成相差聚光器和相差物鏡，在光路上加綠色濾光片．
2 ．聚光器轉盤刻度裏“。”，調節光源使視野亮度均勻．
3 將釀酒酵母水浸片或枯草芽孢杆菌水浸片置於載物台上，用低倍物鏡（10X）在明視野配光並聚焦樣品．
4 ．將聚光器轉盤刻度置“10 片（與所用10X物鏡相匹配）。注意由明視野轉為環狀光闌時，因進光皿減少．要把聚光器的光圈開足，以增加視野亮度，
5 ．取下目鏡，換上合軸望遠鏡．用左手指固定望遠鏡外筒，一邊觀察，一邊用右手轉動其內簡，使其升降．對焦使聚光器中的亮環和物鏡中的暗環清晰；當雙環分離時，說明不合軸，可用聚光器的中心調節螺旋移動亮環，直至雙環完全重合 .
6 ．按上法依次對其他放犬倍數的物鏡和相應的環狀光闌進行合軸調節．
7 ．取下望遠鏡甲換回目鏡、選用適當放大倍數的物鏡進行觀察。
五、實臉報告
1 結果
繪出你所觀察的釀酒酵母和枯草芽孢杆菌的形態。
2 ．思考題
( 1 ）為什麽說相差顯微鏡的出現是顯徽觀察技術的一大進步？
( 2 ）能否用相差顯微鏡觀察染色標本？
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