一、瓊脂介紹
瓊脂是由植物中提取的一種多糖，主要來源於海生藻類植物。在微生物培養基中，瓊脂一般隻做為凝固劑使用，流體狀培養基中瓊脂的添加量一般為0.5-2g/L（瓊脂使培養基具有一定黏度，阻止液體對流，常用於厭氧菌的培養），半固體培養基中瓊脂的添加量一般為3.5-4g/L（常用於菌種保存、動力試驗等），植物組織培養基中瓊脂的添加量一般為5-10g/L，固體培養基中瓊脂的添加量一般為12-15g/L。
瓊脂粉一般為白色、淡黃色或淡灰色粉末狀，在冷水中不溶解，加熱煮沸或高壓滅菌可使瓊脂溶解（多數瓊脂的熔點在90℃左右），冷卻後可凝成固態（多數瓊脂的凝固點在40℃左右），反複加熱和冷卻雖然可以使瓊脂在液態和固態多次轉換，但瓊脂的凝膠強度會越來越低。
二、瓊脂培養基的製備和使用方法
（1）按照培養基標簽，稱取適量培養基幹粉溶解於純化水中，加熱煮沸至瓊脂完全溶解，分裝試管或錐形瓶；
（2）將分裝後的培養基置於規定的條件下進行滅菌處理（加熱滅菌的培養基可反複煮沸4-6次至培養基完全溶解，傾入平皿中製成平板使用）；
（3）滅菌結束後，待培養基冷卻至50℃左右，可置於47-50℃水浴保溫（可根據實際培養基凝固溫度適當提高水浴溫度），放置時間一般不應超過4小時；
（4）臨用前，加入相應的添加劑成分，搖勻後傾入平板，凝固後備用；或製成斜麵、傾注使用等。
三、注意事項
（1）溶解幹粉時，建議水溫在40℃以下，最高不超過60℃。瓊脂在遇到熱水時，表麵易吸水變硬，結成硬塊，不利於分散溶解。因此在進行幹粉溶解時，宜用冷水，並不停攪拌至分散均勻無團塊，再進行加熱處理；
（2）滅菌前需進行加熱煮沸使瓊脂完全溶解，分散均勻，方可進行分裝試管或錐形瓶，否則分裝後可能出現瓊脂分布不均，凝固性不一；滅菌前的加熱煮沸溶解同時有助於加快高壓滅菌過程的熱穿透，提高滅菌效果，降低滅菌失敗的幾率；
（3）已凝固的培養基不可以再次高溫高壓滅菌。若培養基內成分較穩定，可重新沸水浴溶化一次使用；
（4）需添加抗生素或其他不穩定成分的培養基，需在臨用前，待培養基冷卻至50-55℃時加入，過早或過熱時加入這些成分，易導致不穩定成分分解，降低培養基使用效果；
（5）已凝固的培養基不可反複多次加熱溶化使用。反複加熱易使培養基內營養成分分解，瓊脂的凝膠強度下降，一般成分較穩定的培養基允許溶化一次使用。
（6）已凝固的培養基，不可在結冰條件下保存。培養基結冰會使瓊脂內部結構破壞，導致失水或凝固性變差，瓊脂變性。
四、常見問題解答
（1）滅菌前培養基沒有進行加熱煮沸溶解，結果發現滅菌後的培養基製成的平板部分凝固性不好，或瓶內的培養基出現分層現象（底層凝固，上層不凝固），是怎麽回事？
答：這是由於瓊脂分布不均導致的。瓊脂的比重較大，易下沉至底部，高壓滅菌後雖然從外觀上看培養基澄清透明，瓊脂已經完全溶解，但實際上瓊脂仍然集中溶解在底部，導致上層含有極少量瓊脂，下層含有大量瓊脂，因此製成的平板會出現部分不凝固或凝固不完全的現象，瓶內的培養基冷卻後出現分層，下層因含大量瓊脂而呈固態，上層瓊脂少呈液態。在滅菌前若加熱煮沸使瓊脂完全溶解分布均勻，滅菌後就不會出現此現象。若滅菌前未進行加熱溶解，則滅菌後使用前需充分搖勻，確保溶解在底層的瓊脂均勻分散開，也可避免出現平板不凝固或凝固不均勻的問題。
此外，偏酸的環境不利於瓊脂的凝固。因此在製備一些pH偏酸的培養基時（pH＜4.5），需將瓊脂與其他成分分開滅菌，冷卻至50℃左右再混合均勻製成平板。在培養基的製備時若出現瓊脂不凝固，也有可能是因為配製或滅菌過程出現問題，導致培養基的pH過低，瓊脂不能凝固。
（2）滅菌後的瓊脂培養基若未用完，可以下次再重新溶化繼續使用嗎？
答：《GB4789.28 -2013培養基的試劑和質量要求》標準中指出，“含有活性化學物質或不穩定性成分的固體培養基也應即配即用，不可二次融化”；因此對於一些已添加抗生素、卵黃、血清等不穩定成分的培養基，不可以再次融化使用。而對於一般的培養基，可使用沸水浴或采用有相同效果的方法使培養基融化，再次融化後未用完的培養基則不能重新凝固留待下次使用。
（3）已經製備好的固體培養基平板，可以保存多久使用？應如何保存？
答：《GB4789.28 -2013培養基的試劑和質量要求》標準中指出，“在保證其成分不會改變條件下保存，即避光、幹燥保存，必要時在5℃±3℃冰箱中保存，通常建議平板不超過2周～4周，瓶裝及試管裝培養基不超過3個月～6個月，除非某些標準或實驗結果表明保質期比上述的更長。”“建議需在培養基中添加的不穩定的添加劑應即配即用，除非某些標準或實驗結果表明保質期更長；”“培養基的貯存應建立經驗證的有效期。觀察培養基是否有顏色變化、蒸發（脫水）或微生物生長的情況，當培養基發生這類變化時，應禁止使用。”
因此，對於含有不穩定成分的培養基平板，最好是現配現用，除非經過效期驗證，可適當延長保存期限（可以在2-8℃保存或驗證過的溫度下保存）；一般較穩定的培養基可在適宜條件下保存2-4周（一般建議在10-25℃左右的環境保存，溫度過低時培養基易出現冷凝水，溫度過高易導致培養基失水及部分營養成分失效），或通過有效期驗證延長保存期限；若保存後的培養基出現明顯外觀變化或汙染微生物，則不能使用。不可在0℃以下結冰保存。
（4）滅菌後的培養基，在47-50℃呈液態狀可以保存多久？是否可以過夜或更長時間保存？對培養基性能會有影響嗎？
答：《GB4789.28 -2013培養基的試劑和質量要求》標準中指出，“融化後的培養基放入47℃～50℃的恒溫水浴鍋中冷卻保溫(可根據實際培養基凝固溫度適當提高水浴鍋溫度)，直至使用，培養基達到47℃～50℃的時間與培養基的品種、體積、數量有關。融化後的培養基應盡快使用，放置時間一般不應超過4 h。”
多數培養基中含有蛋白腖、酵母浸粉、葡萄糖等成分，蛋白腖、酵母浸粉中含有多種維生素、微量元素等營養成分，在長時間處於較高溫度下保存易導致這些營養成分降解，而長時間熱保溫條件下的葡萄糖則易分解焦化，導致培養基pH下降。因此，長時間的保溫會使培養基的營養成分流失，靈敏度下降，培養效果變差，瓊脂的凝膠強度也會降低。保溫過夜或更長時間這種操作方法是不規範的，應當按照標準要求，在保溫4h內使用。
（5）按照標準進行培養基配製時，有時候製成的平板凝膠強度較低，可否增加瓊脂含量來提高平板的凝膠強度？是否會對微生物的生長造成不良影響？
答：目前市場上的銷售的瓊脂來源、工藝、純度等各方麵存在差異，導致不同的瓊脂凝膠強度存在差別。因此在《GB4789.28 -2013培養基的試劑和質量要求》標準中也明確指出，允許“根據所需凝膠作用的效果改變瓊脂的用量”。
瓊脂在培養基中，主要起固化的作用，因此適量的增加或減少瓊脂含量並不會對微生物生長造成不良影響。但要注意，在使用半固體瓊脂觀察動力時，若要進行瓊脂調整，需進行試驗驗證，若培養基添加瓊脂過多，凝膠強度偏高，會導致部分細菌動力效果不明顯；而對於製成平板的固體培養基，適量調整瓊脂不會對培養基的靈敏度和生長率造成不利影響（即不影響微生物的生長和計數），但若瓊脂過多，平板偏硬，會使菌落稍偏小；若瓊脂偏少，平板偏軟，會使一些動力強的細菌菌落稍大，甚至蔓延，劃線接種時也會出現易劃破平板的問題。
（6）平板進行塗布接種或劃線接種時，經常出現菌落片狀生長或蔓延，是什麽原因？
答：通常是由於平皿表麵水過多導致的。剛製備好的平板，可進行適當的幹燥處理，在培養箱中預培養2h左右或在超淨工作台中開蓋中風吹15-30min，降低平板表麵的含水量。進行塗布操作時，9cm平板建議接種量為100μL，最高不超過200μL。
（7）平板在培養箱中培養後，有的平板幹裂嚴重，有的平板出水嚴重，是什麽原因？如何解決？
答：主要與瓊脂的保水性和彈性、平板厚度、平皿的透氣性、培養箱條件有關。
瓊脂：不同的瓊脂在保水性方麵略有差異，而瓊脂的彈性會影響是否開裂。彈性差的瓊脂在大量失水後，易出現開裂；而彈性好的瓊脂在大量失水後，易出現變薄或縮小現象。
平板厚度：平板越薄越容易幹裂。通常使用的平板培養基厚度為2-3mm，若培養時間較長或幹裂問題較嚴重，可適當增加培養基厚度。
平皿的透氣性：新製備的平板一般不容易出現幹裂問題，而長時間保存的平板更容易出現幹裂現象，這主要與平板的透氣性有關。平板的密封性越好，保存和培養過程中培養基失水越少。雖然增加平板的密封性可以減少水份流失，但並非密封性越高越好。一些需氧型微生物（如銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌），在密閉環境中生長較差，需要良好的透氣性才能較好的生長。而對於一些生化鑒定類培養基平板（如XLD平板），細菌的生長和生化反應的發生需要有氧氣參與，密閉的平皿反而會得到較差的實驗結果。因此在選用平皿時，需結合實際情況選擇合適透氣性的平皿。
培養箱條件：培養箱是影響平皿幹裂問題的關鍵因素之一。大型的培養箱為了保證內部溫度均一，通常帶有較強的鼓風係統，內部有較強的空氣流動。而氣流越強，則越容易導致平皿失水。而對於一些沒有鼓風係統的小型培養箱，則很少會出現平皿幹裂現象。在培養箱內擺放平皿時，應盡量避開風口氣流大的位置，同時遠離培養箱內部發熱板。
因此，在遇到平板幹裂問題時，可通過增加平板培養基厚度、培養箱內增加擋板降低氣流或避開風口、選擇合適透氣性的平皿、減少使用長期存放的平板等方麵進行解決。
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