一、目的要求
1 ．學習並掌握用富爾根氏染色法進行體內觀察微生物擬核的原理和方法．
2 初步了解和掌握提取細菌染色體DNA 及其體外觀察的方法．
二、墓本原理
富爾根氏（Feulgen）染色法是根據席夫氏（Schiff） 的試劑進行的反應而建立的微生物擬核染色法。席夫氏試劑含有堿性複紅和亞硫酸，堿性複紅與亞硫酸結合後，失去醒式結構而變為無色，當DNA 經酸作用而生成的醛化合物與席夫氏試荊結合後，使醒式結構恢複，合成一種帶紫紅色
的堿性複紅衍生物．此染色法對DNA具有特異性，微生物細胞用此法染色後，可在普通光學顯微鏡下原位觀察到細胞內擬核的形態和位置。
富爾根氏染色法主要分兩步：（a）將細胞用1 moL HCL溫和水解．使DNA中的嗦吟堿與戊箱分開，放出戊糖的醛基；( b ）放出的戊搪醛基與席夫氏試荊作用後呈紫紅色．
如果將微生物細胞裂解．使其擬核（即染色體DNA ）被抽提出來，通過溴化乙錠染色並進行瓊脂特凝膠電泳，便可觀察到釋放到細胞外的染色體DNA . EB 是一種扁平分子染料，可特異性括人DNA 堿基對之間，在紫外線照射下，使DNA 呈現熒光，因而可觀察到凝膠中的染色體DNA ，由幹在提取過程中大分子染色休DNA 的隨機斷裂，所以經凝膠電泳後形成的是一條不整齊的濃的熒光帶（圖IV 一6 ) .
用EB 染色法進行的體外觀察染色體DNA也分
兩步進行：〔 a ）將細胞裂解後抽提染色體DNA ; ( b ）通過含有EB 的瓊脂精凝膠電泳在紫外光下觀察染色體DNA熒光棒．
三、器材
1 ．菌種 釀酒酵母，大腸杆菌．
2 溶液或試劑1mol/L HCL2 ％徽酸，Schandiun固定液，亞硫酸水溶液、席夫氏試劑，TE緩衝液，10 % SDS，蛋白酶K ( 20 mg /ml ) , 5 mol/L NaCL，CTAB/NACL,酚／氯仿／異戊醇（25 : 24 : 1 ) , 異丙醇，70 ％乙醇，溴酚藍加樣緩衝液，TAE 電泳緩衝液．
3 儀器或其他用具台式高速離心機，5 ml塑料離心管，真空幹澡器，俄酸燕氣瓶等．
四、操作步驟
l 富爾根氏染色法
( l ）取培養8 一10h 的釀酒酵母塗片，室溫下風幹
( 2 〕 將塗片置於盛有2 ％鋨酸的蒸氣瓶口上，用俄酸蒸氣固定5min ，然後放入加熱至60℃ 的Schandiun固定液中10min 。
( 3 ）用水衝洗固定後的標本．然後放在60 ℃ 1mol/L HCL中水解8min，水洗．
( 4 ）用席夫氏試荊作用30~40 min ,
( 5 ）由席夫氏試荊中取出放在亞硫酸水溶液中洗5min .
( 6 ）由亞硫酸水溶液中取出水洗，幹燥後，用油鏡觀察．
2 DNA的抽提和溴化乙錠染色
( l ）取4.5ml大腸杆菌過夜培養液幹5ml塑料離心管中，12 000 r/min 離心1~2 min ，棄上清．
( 2 ）將細胞沉澱懸浮於1 . 7 mlTE 緩衝液中．加入10 %SDS90ul和20mg/ml的蛋白酶K 9 ul ，混勻，37度保溫lh .
( 3 ）加入5mol/L NaCI 300 ul ，充分混勻，再加入240ulCTAB/NACL，混勻，置65℃ 水浴10 min 。
（4）加入等體積的酚／氯仿/異戊醇〔 25 ：24：l ）混勻，12 O00r ／min 離心5min
（5）將上清水相轉人另一潔淨的塑料離心管中，加0 . 6 倍體積的異丙醇使DNA 沉澱下來．
（6）快速離心數秒鍾，棄上清，用沁外的乙醇淋洗DNA2次，將DNA沉澱經真空幹燥後溶於300 ul TE緩衝液中．
用此法獲得的染色體DNA 可用於限製性酶切等分子生物學操作．
( 7 ）取少量 （約3 ~5ul）提取的DNA樣品（其餘置於一20 ℃ 保存），加入3 ul溴酚藍加樣緩衝液，混勻後上樣進行瓊脂糖凝膠電泳1~2 h .
瓊脂鍺中加有EB ．在電泳過程中，EB 將插人DNA 分子中，
( 8 ）戴上一次性塑料手套（EB 是強誘變劑）將凝膠取出置於紫外分析儀上觀察染色體DNA 熒光帶．
五，實驗報告
1 ．結果
( l ）根據自己的實驗結果，繪圖表示細胞內核的形態和位置．
( 2 ）繪圖表示你所觀察到的瓊脂糖接膠中的染色體DNA 帶。
2 思考題
( l ）大腸杆菌細胞內的染色體是環形的還是線形的？你從凝膠上觀察到的體外染色體DNA 應是環形的還是線形的？為什麽？
( 2 ）凝膠上顯現的染色體DNA帶為什麽是不整齊的？
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