菌落總數測定標準要點解析

一、稱樣

  （1）一般稱量25g，由於稱樣量較大，標準中對於稱樣的準確性未作出明確規定，微生物室常用稱樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原則，即實際稱樣時可根據樣品情況稱取超出25g（如硬質糖果等，檢驗人員應依據樣品實際情況決定如何稱樣）；

  （2）對於部分食品添加劑已明確須稱取1.0g的，則須嚴格精確稱量。

二、樣品稀釋

  （1）固體或半固體：稱取25g樣品於均質袋中，加入已滅菌的生理鹽水225g，稍捏碎（特別是糕點/麵包及其他澱粉製品），放入拍擊式均質器均質1min，此時即製備成1：10的樣品勻液。以移液器或滅菌吸取該液體至9mL滅菌生理鹽水試管中，換上新的滅菌移液器槍頭，緩緩吸取液體後反複吹打2次，此時即製備成1：100的勻液，以此類推，製備10倍係列稀釋勻液。

  （2）液體樣品：直接吸取原液進行檢驗，稀釋時可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。

三、稀釋度的選取

  液體樣品可直接取原液進行檢驗；固體或半固體則必須依據檢驗經驗，選取2-3個適宜稀釋度進行檢驗（一般樣品選取1：10，1：100，1：1000三個稀釋度進行檢驗。若遇到不常做的樣品，可適當延長稀釋度至1：100000甚至1：1000000）。

四、質量控製

  空白對照：分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對照。（若空白有菌落生長則該實驗無效）。

五、平板計數瓊脂（PCA）

  滅菌條件為121℃、15min。一般情況下於500mL敞口錐形瓶（三角瓶）中配製400mL/瓶。

六、

  有時樣品基質比較特殊，樣品勻液有細小的顆粒與菌落不易區分，此時可采用如下方法進行區分：

 （1）配製1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又稱紅四唑或紅四氮唑，簡稱TTC），高壓滅菌後避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為：121℃、20min；

 （2）待PCA瓊脂培養基冷卻至適宜傾注溫度時，無菌加入上述TTC溶液2mL，充分搖勻（此時PCA中TTC濃度為0.005%）。

  加入TTC的目的及注意事項：培養後，菌落被TTC染成紅色，而樣品顆粒不變色，方便計數；PCA中TTC的濃度不宜過高，否則會抑製微生物的生長，對實驗結果產生影響。（特殊情況下方添加TTC，常規實驗無須添加，特別是對於菌落數量較少的樣品不宜添加。方法來源依據為《化妝品衛生規範》中菌落總數測定相關章節）

七、稀釋液

  常采用0.85%氯化鈉溶液（生理鹽水），121℃、15min高壓滅菌後冷卻備用。

八、

  傾注培養基時，根據對樣品汙染情況的估計（同一類型樣品的微生物檢測經驗），若樣品有表麵蔓延生長的可能性，則待第一次傾注的瓊脂凝固後，可在表麵再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計數。

九、

  水產品30±1℃培養72±3h；其它樣品36±1℃培養48±2h。注意：此處的“水產品”是指生魚片、魷魚幹等未經深度加工的水產品。

十、

  本標準的重難點為菌落計數及計算。除標準中已說明的要求外，有以下幾點需要注意：

 （1）菌落計數時，從低稀釋度的平板開始計數。若所有平板上的菌落數均小於30CFU，則須計數所有平板上的菌落數，但僅采用最接近30CFU的兩個平板的菌落數來計算最終菌落總數。

  以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：

 （2）當第一稀釋梯度一個板上菌落數高於30，另一個低於30，則依據標準應當以介於30-300之間的菌落數作為該稀釋梯度的菌落數。（存在爭議，實際遇到該類情況時應謹慎對待）

  以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：

稀釋度	菌落數		平均數	計算結果	修約後結果
1:10	37	28	32.5	37*10=370	370CFU/g
1:100	3	4	3.5		370CFU/g
1:1000	0	0	0		370CFU/g

 （3）若所有平板上的菌落數均大於30CFU，則隻計數30-300CFU之間的平板上的菌落數，並采用這些數據，依據標準中給定的公式，進行最終菌落總數的計算，此時將大於300CFU的記為“多不可計”，以“TNTC”表示。

  以固體樣品舉例，根據標準中給定的公示，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：

 （4）若所有稀釋度的平板菌落數都大於300，則不能所有都計為TNTC，必須將最高稀釋度的兩個平板上的菌落逐一地計數，再計算平均數，該平均數為該梯度的菌落總數，其餘平板上的菌落數可記為TNTC。

  以固體樣品舉例，菌落數選取、計算過程及結果修約如下：

稀釋度	菌落數		平均數	計算結果	修約後結果
1:10	TNTC	TNTC	/	（（312+301）/2）*10=306500	31000CFU/g
1:100	TNTC	TNTC	/		31000CFU/g
1:1000	312	301	306.5		31000CFU/g

 （5）計算菌落總數時，須嚴格按照標準要求進行計算。

  特殊情況：

  ①若所有平板均無菌落生長，則以小於1乘以最低稀釋倍數。“最低稀釋倍數”並不是固定不變的，與檢驗人員選取的稀釋度有關。如：某樣品多次檢驗後發現菌落總數較高，檢驗人員在梯度稀釋後取1:1000、1:10000、1:100000三個梯度的稀釋液傾注平板，最終所有平板上的均無菌落生長，則計算過程為＜1×1000，最終結果為＜1000CFU；若選取1:10、1:100、1:1000三個梯度的稀釋液傾注平板，均無菌落生長，則最終結果為＜10CFU。因此，稀釋度的選擇對於結果存在較大影響，選擇時應謹慎。

  ②最低稀釋度兩個平板隻有一個平板上長了1個菌落，若為固體樣品且本次檢驗的最低稀釋倍數為1:10，此時計算過程為（1+0）/2×10=5，由於默認固體樣品最小檢出量為10CFU，故本次檢驗的菌落總數結果為10CFU。注意：對於該情況一直存在爭議，不同的檢驗人員可能做法不一，有人保留為5CFU，有人保留為10CFU，並無固定做法。（建議檢驗人員保持一貫做法，不要隨意更改）

  舉例如下：

十一、

  對於水產品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數含量較高、限量值較大的食品類別，建議多增加稀釋梯度（可稀釋至10-4甚至10-5），避免稀釋度較低、濃度較大導致培養後平板上菌落蔓延、彌散而難以計數甚至無法計數。

  本文轉載自微信公眾號食品微生物檢測。

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