無菌檢查方法適用性試驗

   方法適用性試驗。為保證無菌檢驗結果的準確可靠，當建立產品的無菌檢查法時，應進行方法適用性試驗，以確認供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計，所采用的方法適合於該產品的無菌檢查。若該產品的生產工藝，原、輔料組分或檢驗條件發生改變時，應重新進行方法適用性試驗。

   方法適用性試驗時，按“供試品的無菌檢查”的規定及下列要求進行操作試驗。供試品對每一試驗菌應逐一進行方法確認。FTM培養基主要用於厭氧菌的培養，也可用於需氧菌培養；TSB培養基用於真菌和需氧菌的培養。在進行陽性試驗時金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌應加入到FTM培養基中培養，而枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲黴應加入到TSB培養基中培養。

   薄膜過濾法的適用性試驗。將規定量的供試品按薄膜過濾法過濾，衝洗，在最後一次的衝洗液中加人小於100cfu的試驗菌，過濾，濾淨後每個培養器內灌注100ml培養基；因方法適用性試驗旨在確認供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計，可向最終培養體係中直接加人小於100cfu的試驗菌。方法適用性試驗應在生物安全二級實驗室內進行，不得在潔淨實驗區內操作菌液，操作全程需要注意保持環境的無菌性。取裝有同體積培養基的容器加人等量的試驗菌，作為陽性對照。含培養基的各試驗容器按規定溫度培養不得超過5天。各試驗菌同法逐一進行驗證，以大腸埃希菌代替培養基靈敏度實驗中的銅綠假單胞菌，其餘同培養基靈敏度試驗。大腸埃希菌的菌液製備同金黃色葡萄球菌。藥品生產單位也可增加從生產環境及產品中發現的常見汙染菌作為試驗用菌，其意義是更能確定所選方法適合該產品中汙染菌的檢出。

   供試液和衝洗液經過薄膜過濾時流速不宜過快；每張濾膜每次衝洗量為100ml，總衝洗量一般不超過500ml，最高不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。方法適用性實驗的目的之一就是要尋找衝洗量相對較小的方法。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及衝洗液覆蓋整個濾膜表麵。常規選用濾膜直徑約為50mm，若使用其他尺寸的濾膜，應對稀釋液和衝洗液體積進行調整，並重新驗證。

   直接接種方法適用性試驗。取適宜裝量的FTM培養基6管，分別加入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌的菌液各2管；取適宜裝量的TSB培養基6管，分別加入枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲黴菌液各2管。每管加菌量小於100cfu。其中1管接人規定量的供試品，另1管作為陽性對照，各試驗管按規定的溫度培養不得超過5天。

   方法適用性試驗的結果判斷。與陽性對照比較,如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，並且與陽性對照容器內的對照菌培養結果相似，則供試品在該檢驗條件下無抑菌作用或抑菌作用消除，可按該法進行供試品的無菌檢查法檢查。如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品在該檢驗條件下有抑菌作用，應重新進行方法適用性試驗。

   具有抗菌活性的供試品，若采用薄膜過濾法，可根據供試品的抗菌活性強弱，采用增加衝洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法消除抑菌作用。若采用的是直接接種法，可根據實際情況增加培養基的用量、在稀釋液或培養基中使用中和劑、滅活劑或表麵活性劑等方法消除抑菌性。並重新進行方法適用性試驗。若需使用中和劑、滅活劑或表麵活性劑等，應證明其有效性，且對微生物無毒性。已進行過無菌檢查方法適用性試驗的供試品，按此法進行無菌檢查。無菌檢查時采用的方法應與方法適用性試驗確認的方法相同。

   本文節選自《中國藥品檢驗標準操作規範》（2019版）無菌檢查法章節。

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