一、參考標準
根據《GB4789.38-2012 大腸埃希氏菌計數》中定義，大腸埃希氏菌廣泛存在於人和溫血動物的腸道中，能夠在44.5℃發酵乳糖產酸產氣，IMViC（靛基質、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽）生化試驗為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性杆菌。
二、生化驗證
1、從分離平板中挑取可疑菌落，接種至乳糖發酵培養基（或EC肉湯培養基），44.5℃培養24h，觀察實驗結果。典型的大腸埃希氏菌在乳糖發酵培養基中產酸產氣，培養基由紫色變為黃色，導管中有氣體，有時液麵處可見大量氣泡（在EC肉湯中可觀察到導管內有氣體產生）。
乳糖發酵培養基試驗現象
備注：a為大腸埃希氏菌ATCC25922，b為乙型副傷寒沙門氏菌，c為大腸埃希氏菌CMCC44102，d為空白對照
2、從分離平板中挑取疑似菌，進行IMViC生化實驗，接種至蛋白腖水、MR-VP、西蒙氏枸櫞酸鹽培養基（可選用大腸杆菌鑒定條或成套生化鑒定管等），36±1℃培養24-48h，記錄生化反應結果。大腸埃希氏菌IMViC試驗為＋＋－－或－＋－－（大多數大腸埃希氏菌反應為＋＋－－，－＋－－反應的大腸埃希氏菌較為少見）。
注：靛基質試驗需在培養結束後，在蛋白腖水中滴加靛基質試劑，立即或數秒內出現玫紅色環為陽性反應，黃色環為陰性反應；甲基紅試驗需在培養結束後，在MR-VP培養基中滴加甲基紅試劑，立即顯紅色為陽性反應，橙黃色為陰性反應；V-P試驗需在培養結束後滴加V-P試劑，繼續培養0.5-4h，如出現變紅現象即為陽性反應，不變紅為陰性反應；西蒙氏枸櫞酸鹽可直接觀察結果，如出現變藍即為陽性反應，不變色為陰性反應。
3、革蘭氏染色。在挑取疑似菌落後對其疑似菌落進行革蘭氏染色（革蘭氏染色液方法 點擊查看相關文章），大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性杆菌，革蘭氏染色結果為紅色短杆菌。
革蘭氏染色液微生物質控結果
備注：紅色杆菌為大腸埃希氏菌，紫色球菌為金黃色葡萄球菌
三、結果判定
若待測菌能夠在44.5℃發酵乳糖產酸產氣，並且同時滿足IMViC（靛基質、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽）生化試驗為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性杆菌，即可判定為大腸埃希氏菌。
四、注意事項
極少數不活躍大腸埃希氏菌為乳糖遲緩發酵或不發酵類型，在乳糖發酵培養基或EC肉湯培養基中觀察不到產酸產氣現象，需結合其他生化反應進行判斷。
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