一、簡介
單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡稱單增李斯特氏菌，是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人畜的李氏菌的病，感染後主要表現為敗血症、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在於自然界中，食品中存在的單增李氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，因此，在食品衛生微生物檢驗中，必須加以重視。
二、參考標準
《GB 4789.30-2016 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》。
三、檢驗方法以及結果
單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗程序見圖1。
圖1 單核細胞增生李斯特氏菌定性檢驗程序
1.分離
將樣品進行梯度稀釋後，選擇合適的稀釋度塗布李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，於36℃±1℃培養24h～48h。
單增李斯特氏菌的典型菌落在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。在李斯特氏菌顯色平板上為藍色菌落，菌落周圍有一不透明環。如圖2所示：
A：PALCAM瓊脂平板；B：李斯特氏菌顯色平板
圖2 單增李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板和李斯特氏菌顯色平板典型菌落特征
2.染色鏡檢
挑取純培養的單個可疑菌落，進行革蘭氏染色，單增李斯特氏菌為革蘭氏陽性菌，鏡檢為紫色短杆狀。如圖3所示：
圖3 單增李斯特氏菌革蘭氏染色鏡檢結果
3.動力試驗
挑取純培養的單個可疑菌落穿刺SIM動力培養基，於25℃～30℃培養48h。單增李斯特氏菌有動力，在SIM培養基上方呈傘狀生長。如圖四所示：
圖4 單增李斯特氏菌SIM動力試驗結果
4.過氧化酶試驗
挑取純培養的單個可疑菌落，滴加3%過氧化氫酶試劑後，單增李斯特氏菌菌落在30s內產生大量氣泡。如圖5所示：
圖5 單增李斯特氏菌過氧化氫酶試驗結果
5.生化鑒定
選擇過氧化氫酶陽性反應的菌落，繼續使用betway必威西汉姆联單增李斯特氏菌的生化鑒定條進行生化鑒定，單增李斯特氏菌生化反應結果為木糖陰性、鼠李糖陽性、葡萄糖陽性、麥芽糖陽性、甘露醇陰性、七葉苷陽性、MR-VP陽性。如圖6所示：
圖6 單增李斯特氏菌生化鑒定條試驗結果
注意事項：MR試驗需在培養結束後滴加甲基紅試劑1滴，立即觀察結果，出現紅色為陽性反應；VP試驗需在培養結束後滴加VP試劑（甲液0.3mL，乙液0.1mL），混勻後觀察結果（4小時內），出現紅色為陽性反應。
6.溶血試驗
將新鮮的羊血瓊脂平板底麵劃分為20～25個小格，挑取純培養的單個可疑菌落刺種到血平板上，每格刺種一個菌落，並刺種陽性對照菌（單增李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌）和陰性對照菌（英諾克李斯特氏菌），穿刺時盡量接近底部，但不要觸到底麵，同時避免瓊脂破裂。36℃±1℃培養24h～48h，於明亮處觀察。
單增李斯特氏菌呈現狹窄、清晰、明亮的溶血圈，英諾克李斯特氏菌無溶血圈，伊氏李斯特氏菌產生寬的、輪廓清晰的β-溶血區域。如圖7所示：
A-1、A-2、A-3和A-4均為待測菌落；B：單增李斯特氏菌陽性對照；
C：伊氏李斯特氏菌；D：英諾克李斯特氏菌
圖7 單增李斯特氏菌溶血試驗結果
7.協同溶血試驗
在羊血瓊脂平板上平行劃線接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌，挑取純培養的單個可疑菌落垂直劃線接種於平行線之間，垂直線兩端不要觸及平行線，距離1mm～2mm，同時接種單增李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌，於36±1℃培養24h～48h。
單增李斯特氏菌在靠近金黃色葡萄球菌處出現約2mm的β-溶血增強區域，伊氏李斯特氏菌在靠近馬紅球菌處出現約5～10mm的“箭頭狀”β-溶血增強區域，英諾克李斯特氏菌不產生溶血現象。如圖8所示：
A：金黃色葡萄球菌；B：馬紅球菌；C：單增李斯特氏菌陽性對照
D和G：待測菌；E：英諾克李斯特氏菌；F：伊氏李斯特氏菌
圖8 單增李斯特氏菌協同溶血試驗結果
三、結果判定
若待測菌在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷；在李斯特氏菌顯色平板上為藍色菌落，菌落周圍有一不透明環；鏡檢結果為革蘭氏陽性杆菌；有動力、過氧化酶陽性、木糖陰性、鼠李糖陽性、葡萄糖陽性、麥芽糖陽性、甘露醇陰性、七葉苷陽性、MR-VP陽性，可初步判斷為單增李斯特氏菌。
注：本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。
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