選用和設計培養基的原則,方法及製備過程:
原則:目的明確 ,營養協調,經濟節約物理化學條件適宜
方法:生態模擬,查閱文獻精心設計,試驗比較
步驟:稱量,熔化,調PH,過濾,分裝,加塞,包紮,滅菌,冷卻,無菌檢查
培養基種類:
一,按成分的不同分
天然培養基,合成培養基,半合成培養基
二,按培養基的物理狀態分
固體培養基,液體培養基,半固體培養基
三,按培養基用途
基礎培養基,選擇培養基
加富培養基,鑒別培養基
消毒與滅菌
消毒:消滅病原菌和有害微生物的營養體
滅菌:殺滅一切微生物的營養體,芽胞和孢子.
方法:
一,物理的方法:加熱,過濾,輻射
二,化學的方法:用化學試劑抑製或殺滅微生物.主要破壞細菌代謝機能.如重金屬離子,磺胺類藥物及抗生素等.
加熱法:
幹熱法:火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌.
1,火焰灼燒適用於接種環,接種針和金屬用具如鑷子等,試管口和瓶口,塗布用玻璃棒.
2,熱空氣滅菌利用高溫幹燥空氣(160-170C)加熱滅菌1-2h,適用於玻璃器皿和培養皿等.原理加熱使蛋白質變性,與水的含量有關,當環境和細胞含水量越大,凝固越快.
3,注意事項:
1)培養基,橡膠製品,塑料製品不能用此法;
2)溫度控製在<180°;
3)物品不能太擠;
4)溫度降至70°時才開箱門.
濕熱法 :
原理:因為濕熱中菌體吸水,蛋白質容易凝固,因蛋白質含水量增加,所需凝固溫度降低;濕熱的蒸氣有潛熱存在.所以效果比同溫度下幹熱好.
高壓蒸汽滅菌法:
1,設備:高壓滅菌鍋
2,時間長短根據滅菌物品的種類和數量不同有所變化.
3,適用於培養基,工作服,橡膠物品等的滅菌,也可用於玻璃器皿的滅菌.
4,注意事項:
1)冷空氣徹底排除;2)加水;3)壓力降為"0"時方可打開.
常壓蒸汽滅菌:
對於不宜用高壓蒸汽滅菌的培養基如明膠培養基,牛乳培養基,含糖培養基等可采用此法.徹底滅菌則采用間歇滅菌方法.
煮沸滅菌法:
適用注射器和解剖器皿,時間10-15min,
超高溫殺菌
135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態食品.
優點 :保持食品價值和營養成分.
過濾除菌:
原理:介質在有壓力時阻隔微生物.
適用範圍:許多材料如血清,抗生素及糖溶液采用此法.
設備:蔡氏過濾器,濾膜過濾器.
優缺點:不破壞培養基成分,隻適用少量濾液.需 大量無菌空氣以及淨化工作台.
注意事項:1,壓力適當;
2,無菌條件下進行;
3,防止滲透現象.
輻射滅菌:
原理:紫外線波長在200-300nm,具有殺菌作用,以265-266殺菌力強.此段波長易被細胞中核酸吸收;可產生臭氧和過氧化氫.殺菌效力與強度和時間的乘積成正比.
缺點:穿透力不大.距照射物<1.2m為宜.
應用:無菌室,醫院.
注意事項:對眼睛和皮膚有刺激作用.
射線滅菌:r射線,穿透力強,適用於堆積物品的滅菌.
化學藥品滅菌:
原理:應用化學製劑破壞細菌代謝機能.
殺菌劑如重金屬離子;
抑菌劑如磺胺類及多數抗生素.
注意:與藥品的濃度高低,時間長短,微生物種類以及微生物所處的環境有關.
常用化學殺菌劑有:乙醇,醋酸,石碳酸
福爾馬林,升汞,高錳酸鉀,新潔爾滅等
實驗二,微生物的分離,純化及培養技術
分離與純化:從混雜的微生物群體中獲得隻含某一種或某一株微生物的過程.
為什麽要進行純培養:平板上的單一菌落並不一定保證是一種菌.
常用的分離,純化方法:
單細胞挑取法 稀釋塗布平板法
稀釋混合平板法 平板劃線法
稀釋塗布平板法 :
原理:
步驟: 1,倒平板: 牛肉膏蛋白腖培養基,高氏I號培養基,查氏培養基冷卻至55-60℃時,混勻後倒平板,牛肉膏蛋白腖培養基倒4皿,高氏I號培養基和查氏培養基各倒3皿.
2,製備汙水稀釋液:10g土樣,加入90ml無菌水中,在三角瓶中振搖20min.取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中,以此類推,製成不同稀釋度.
3,塗布:將上述每種培養基平板底麵標記稀釋度,然後用無菌吸管從最後三種稀釋度,即10-4,10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上,用玻棒塗布.
4,培養:高氏I號和查氏倒置培養於28℃培養箱中培養3-5days,牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基在37℃培養1-2days.
5,挑菌落:轉至斜麵,檢查是否一致,保存.
平板劃線法:
1,倒平板,標記培養基名稱,編號和實驗日期.
2,劃線方法
稀釋混合平板法 :
1,先加菌
2,倒平板時注意培養基溫度
3,混合均勻
微生物培養技術
1,斜麵接種
2,液體培養基接種
3,穿刺接種
4,將已接種的斜麵,半固體和液體培養 基放置培養箱中培養
5,將生長好的菌種用牛皮紙包好,置4℃冰箱中保存.
實驗三,菌種保藏
幾種常用的保藏方法:
1,傳代培養法
保藏的菌種通過斜麵,穿刺或皰肉培養基(用於厭氧細菌)培養好後,置4C 冰箱中存放,定期進行傳代培養,再存放.
可用膠塞代替棉塞或在斜麵上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期.
2,載體法
使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行幹燥.
常用的載體有土壤,砂土,矽膠,明膠,麩皮,磁珠和濾紙片等.
3,懸液法
將細菌,酵母菌細胞懸浮在一定的溶液中保存.
溶液包括蒸餾水,糖溶液,磷酸緩衝液,食鹽水等.
4,冷凍法
使菌種始終存放在低溫環境下的保藏方法.包括低溫法和液氮法.
此法關鍵是要克服細胞的冷凍損傷.注意控製降溫速率及保護劑的使用.
5,真空幹燥法
這類方法包括冷凍真空幹燥法和L-幹燥法.
冷凍真空幹燥法是將要保藏的微生物樣品先經低溫預凍,然後在低溫狀態下進行減壓幹燥.
L-幹燥法則不需要低溫預凍樣品,隻是使樣品維持在10-20C 範圍內進行真空幹燥.
操作方法
1,斜麵保藏法
將菌種轉接在適宜固體斜麵培養基上,待其充分生長後,用牛皮紙將棉塞部分包紮好(棉塞換成膠塞效果更好),置4C 冰箱中包藏.
保藏時間依微生物的種類而定.黴菌,放線菌及芽孢菌保存2-4個月移種一次,酵母菌間隔兩個月,普通細菌一個月,假單胞菌兩周傳代一次.
此法優點是操作簡單,使用方便,缺點是保藏時間短,易被汙染.
2,液體石蠟保藏法
將無菌石蠟加在已長好菌的斜麵上,其用量以高出斜麵頂端1CM為準,使菌種與空氣隔絕.
將試管直立,置低溫或室溫下保存.
此法實用且效果較好.黴菌,放線菌,芽孢菌可保藏兩年以上,酵母菌可保藏1-2年,普通細菌也可保藏1年左右.
3,穿刺保藏法
按穿刺接種方式培養菌種,菌種長好後用膠塞封嚴,置4℃冰箱存放.
4,砂土管保藏法
(1)河砂處理
取河砂若幹加入鹽酸10% ,加熱煮沸30min除去有機機質.倒去鹽酸溶液,用自來水衝洗至中性,最後一次用蒸鎦水衝洗,烘幹後用40目篩子過篩,棄去粗顆粒,備用.
(2)土壤處理
取非耕作層不含腐殖質的痩黃土或紅土,加自來水浸泡洗滌數次,直至中性.烘幹後碾碎,用100目篩子過篩,粗顆粒部分丟掉.
(3)砂土混合
處理妥當的河砂與土壤按3:1的比例摻合(或根據需要而用其他比例,甚至可全部作砂或土)均勻後,裝入10x100mm的小試管或安瓿管中,每管分裝1g左右,塞上棉塞,進行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次),最後烘幹.
(4)無菌檢查
每10支砂土管隨機抽1支,將砂土倒入肉湯培養基中,30℃培養40h,若發現有微生物生長,所有砂土管則需重新滅菌,再作無菌試驗,直至證明無菌後方可使 用.
(5)菌懸液的製備
取生長健壯的新鮮斜麵菌種,加入2-3ml無菌水(每18x180mm 的試管斜麵菌種),用接種環輕輕將菌苔洗下,製成菌懸液.
(6)分裝樣品
每支砂土管(注明標記後)加入0.5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜), 用接種針拌勻.
(7)幹燥
將裝有菌懸液的砂土管放入幹燥器內,幹燥器底部盛有幹燥劑.用真空泵抽幹水分後火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口).
(8)保存
置4℃冰箱或室溫幹燥處,每隔一定的時間進行檢測.此法多用於產芽孢的細菌,產生孢子的黴菌和放線菌.在抗生素工業生產中應用廣泛, 效果較好,可保存幾年時間,但對營養細胞效果不佳.
5,冷凍真空幹燥法
(1)凍幹管的準備:中性硬製玻璃,烘幹,滅菌.
(2)菌種培養:細菌芽孢脫落;放,黴孢子豐滿.
(3)保護劑的配製:配製,滅菌,檢查
(4)菌懸液的製備:2-3ml保護劑
(5)分裝樣品:菌懸液每管0.2ml
(6)預凍:程序控溫儀降溫
(7)冷凍真空幹燥:-50℃下抽真空
(8)取出樣品:輕敲鬆散即達標
(9)第二次幹燥:
(10)熔封
(11)存活性檢測:抽取一管進行存活性檢查
(12)保存:4℃保存
實驗三-1,細菌的形態和結構觀察(簡單染色)
一,目的要求
觀察細菌的菌落特征
掌握簡單染色法
在油鏡下觀察細菌個體的形態
學習環境中微生物的檢查方法,並加深對微生物分布廣泛性的認識
二,基本原理
形態觀察主要包括群體的形態和個體的形態觀察.
細菌的基本形態主要分為球菌,杆菌,螺旋菌三大類,近年還發現星狀和四方形細菌等.細菌形態受培養時間,培養基成分,濃度,培養溫度,培養時間等發生變化.
細菌菌落大多表麵光滑濕潤,有光澤,一般菌落較小,質地顏色均勻,同培養基結合不緊密.菌落特征與組成菌落的細胞結構,生長狀況,排列方式,好氣性和運動性直接相關.
細菌個體微小,較透明,必須染色方可呈現.根據細菌個體形態觀察的不同要求,可將染色分為3種類型:簡單染色,鑒別染色,特殊染色.
簡單染色法原理
細菌在中性的環境中帶負電荷,用堿性染料(解離時帶正電荷)如美蘭,結晶紫等進行染色.
實驗三-2:放線菌的形態結構觀察
一,目的要求
掌握放線菌形態結構觀察的方法
觀察放線菌的菌落特征,個體形態及其繁殖方式.
二,原理
放線菌菌落在培養基上著生牢固,與基質結合緊密,難以用接種針挑取.
放線菌細胞一般呈分枝無隔的絲狀,菌絲體分為在培養基內部的基內菌絲和伸出培養基表麵的氣生菌絲.氣生菌絲上部分化成孢子絲,呈螺旋狀,波浪狀或分枝狀.菌絲呈各種顏色,有的能分泌水溶性色素到培養基內.孢子絲長出孢子,孢子形狀各異.由於孢子的存在使菌落表麵呈幹粉狀.
三,實驗內容
(一)菌落形態觀察及菌苔特征的觀察
觀察放線菌菌落表麵形狀,大小,顏色,邊緣以及有無色素分泌;並用接種環挑取菌落,注意在培養基上的著生的緊密情況.區別基內菌絲,氣生菌絲及孢子絲的著生部位.
(二)個體形態特征觀察
可直接觀察,也可置於載片上觀察.注意放線菌菌絲直徑的大小,孢子絲的形狀.
(三)孢子形態觀察
用印片法
(四)用插片法觀察放線菌形態
實驗三-3:黴菌的形態觀察
一,目的要求
觀察黴菌菌落特征
掌握黴菌的製片方法
觀察黴菌個體形態及各種無性孢子及有性孢子的形態
二,基本原理
黴菌是由交織在一起的菌絲體構成.菌絲呈管狀,有的有橫隔將菌絲分割為多細胞(如青黴,曲黴),有的菌絲沒有橫隔(如毛黴,根黴).菌絲直徑比一般細菌和放線菌菌絲大幾倍到幾十倍.菌落形態較大,質地疏鬆,顏色各異,有絲狀,絨毛狀或蜘蛛網狀的菌絲體.
將菌絲體放在水中易變形,將其置於乳酸石炭酸溶液中,保持菌絲體原形.
實驗四,細菌的形態結構觀察(革蘭氏染色,芽孢染色, 莢膜染色)
革蘭氏染色法原理
由於細菌細胞壁結構的不同可將其分為革蘭氏陰性和陽性
芽孢染色原理
芽孢壁比營養細胞的細胞壁結構複雜而且致密,透性低,著色和脫色較營養細胞難.采用堿性染料並在微火上加熱,或延長染色時間,使菌體和芽孢同時染色後,用蒸餾水衝洗,脫去菌體顏色,保留芽孢的顏色.並用另一種對比鮮明的染料 使菌體著色.
莢膜染色原理
負染法,使背景與菌體之間形成一透明區.因莢膜薄,且易變形,所以不能用加熱法固定.
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