一、參考標準
食品國標GB4789.30-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》
二、檢驗流程
單增李斯特氏菌計數有兩種方法：MPN法和平板計數法。
（一）MPN法
1、樣品稀釋均質
無菌操作稱取樣品25g(mL),放入盛有225mL LB1的無菌均質袋內(或均質杯)內，振蕩混勻,製成1∶10的樣品勻液。
用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩慢注於盛有9mL緩衝蛋白腖水或無添加劑的LB肉湯的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液麵),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反複吹打使其混合均勻,製成1∶100的樣品勻液。
製備10倍係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。
2、接種和培養
選取3個適宜連續稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),接種於10mL LB1肉湯,每一稀釋度接種3管,每管接種1mL(如果接種量需要超過1mL,則用雙料LB1增菌液)於30℃±1℃培養24h±2h。每管各移取0.1mL,轉種於10mL LB2增菌液內,於30℃±1℃培養24h±2h。如圖1所示。
圖1
用接種環從各管中移取1環,接種李斯特氏菌顯色平板,36℃±1℃培養24h-48h。菌落形態應為藍綠色菌落，帶白色暈環，如圖2所示。自每塊平板上挑取5個典型菌落(5個以下全選)。
圖2
3、結果判定
根據證實為單核細胞增生李斯特氏菌的陽性管數，查最可能數（MPN）檢索表，報告每g (mL)單核細胞增生李斯特氏菌的MPN值。
在10-1-10-5五個連續稀釋度中確定最適的三個連續稀釋度方法如下：
a）有一個以上的稀釋度3管均為陽性。選擇三管都是陽性結果的最高稀釋度及其相連的兩個更高稀釋度（見示例a、b，表中帶下劃線的數字對應的接種樣品量為最終選取的最適稀釋度，下同）；
b）在未選擇的較高稀釋度中還有陽性結果時，則順次下移到下一個更高三個連續稀釋度（見示例c）；
如果中間有某個稀釋度沒有陽性結果，但更高稀釋度有陽性結果，則將此陽性結果加到前一稀釋度，進而確定三個連續稀釋度（見示例d）；
如果不能按照這個原則找到三個合適的稀釋度，則選擇前一個較低的稀釋度（見表示例e）；
c）沒有任何一個稀釋度3管均為陽性。如果沒有一個稀釋度的3管均為陽性，則選擇三個最低稀釋度（見示例f）；
如果在更高的沒有被選擇的稀釋度還有陽性結果，將此陽性結果加到選擇的最高稀釋度，進而確定三個連續稀釋度（見示例g）。
舉例說明：若單核細胞增生李斯特氏菌的陽性管數的示例為3-3-2-0-1，則選擇的稀釋度為3-2-1，根據MPN檢索表所得樣品中含有單核細胞增生李斯特氏菌為1500CFU/g（mL）。
（二）平板計數法
1、平板計數
樣品均質，如MPN法均質，所用均質的稀釋液為BPW或LB。
選取2個-3個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度的樣品勻液分別吸取1mL以0.3mL、0.3mL、0.4mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色平板上。倒置於培養箱,36℃±1℃培養24h-48h。菌落形態應為藍綠色菌落，帶白色暈環。如圖3所示。
圖3
選擇有典型單核細胞增生李斯特氏菌菌落的平板,且同一稀釋度3個平板所有菌落數合計在15CFU-150CFU之間的平板,計數典型菌落數。分以下6種情況：
①隻有一個稀釋度的平板菌落數在15CFU-150CFU之間且有典型菌落,計數該稀釋度平板上的典型菌落；
②所有稀釋度的平板菌落數均小於15CFU且有典型菌落,應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；
③某一稀釋度的平板菌落數大於150CFU且有典型菌落,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
④所有稀釋度的平板菌落數大於150CFU且有典型菌落,應計數最高稀釋度平板上的典型菌落；
⑤所有稀釋度的平板菌落數均不在15CFU-150CFU之間且有典型菌落,其中一部分小於15CFU或大於150CFU時,應計數最接近15CFU或150CFU的稀釋度平板上的典型菌落；
⑥2個連續稀釋度的平板菌落數均在15CFU-150CFU之間按照公式二計算。
2、結果計算
公式一：T=AB/Cd
注：T：樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落。A：某一稀釋度典型菌落的總數。B：某一稀釋度確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數。C：某一稀釋度用於單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數。d：稀釋因子。
例如，稀釋100倍之後，三個平板典型菌落為80個，取5個典型菌落做鑒定，3個為陽性菌。
公式一計算：T=80×3/（5×10-2）=4800CFU/g（mL）
公式二：T=（A1B1/C1+A2B2/C2）/1.1d
注：T：樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌落。A1：低稀釋度典型菌落的總數。B1：低稀釋度確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數。C1：低稀釋度用於單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數。A2：高稀釋度典型菌落的總數。B2：高稀釋度確證為單核細胞增生李斯特氏菌的菌落數。C2：高稀釋度用於單核細胞增生李斯特氏菌確證試驗的菌落數。d：稀釋因子（低稀釋梯度）。
例如，稀釋10倍之後，三個平板典型菌落為80個，取5個典型菌落均做鑒定，3個為陽性菌。稀釋100倍之後，三個平板典型菌落為10個，取5個典型菌落做鑒定，2個為陽性菌。
公式二計算：T=（80×3/5+10×2/5）/（1.1×10-1）=473CFU/g（mL）
3、結果報告
報告每g(mL)樣品中單核細胞增生李斯特氏菌菌數,以CFU/g(mL)表示；如T值為0,則以小於1乘以最低稀釋倍數報告。
注：本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。
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