霍亂弧菌檢驗方法及結果判斷

一、前言

  1.生物學特征

  霍亂弧菌(Vibrio cholerae)為革蘭氏陰性菌，呈弧形或逗點狀，無芽胞，有菌毛，有些菌株有莢膜，一端有一根粗而長的鞭毛，運動活潑。取霍亂病人米泔水樣糞便作活菌懸滴觀察，可見細菌運動極為活潑，呈穿梭樣或流星狀運動。液體培養物滴片染色鏡檢，可見排列如“魚群狀”弧菌。經人工培養後，易失去弧形而呈杆狀。

  營養要求不高，在普通培養基上生長良好，在pH 6.8-10.2範圍均可生長，耐堿，在pH 8.8-9.0的堿性蛋白腖水或平板中生長良好，因其他細菌在這pH不易生長，故堿性蛋白腖水可作為選擇性增殖霍亂弧菌的培養基。

  在堿性平板上菌落直徑為2mm，圓形，光滑，透明。霍亂弧菌對熱，幹燥，日光，化學消毒劑和酸均很敏感，耐低溫：濕熱55℃，15分鍾，100℃，1-2分鍾，水中加0.5ppm氯15分鍾可被殺死；0.1%高錳酸鉀浸泡蔬菜、水果可達到消毒目的；在正常胃酸中僅生存4分鍾。霍亂弧菌為需氧或兼性厭氧菌，在16-44℃均可生長，最適生長溫度37℃。

  2.流行病學特征

  霍亂弧菌(Vibrio cholerae)是霍亂的病原菌，該病為一種急性烈性腸道傳染病，主要表現為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，發病急，傳染性強，死亡率高，屬於國際檢疫傳染病。共分為139個血清群，其中O1群和O139群可引起霍亂。霍亂弧菌O1群和O139群是烈性腸道傳染病霍亂的病原體。在自然情況下，人類是霍亂弧菌的易感者。人通過攝入霍亂弧菌汙染的食物或水，引起霍亂。進入腸道的霍亂弧菌通過鞭毛運動穿過腸黏膜表麵的黏液層，接近腸黏膜上皮細胞，通過普通菌毛的作用定植。腸道內的環境有利於霍亂弧菌的繁殖，產生霍亂腸毒素，導致疾病的發生。

  霍亂弧菌的主要致病因素是霍亂毒素（cholera toxin，CT），CT是目前已知的致瀉毒素中最強烈的毒素,可造成腸液大量分泌，導致嚴重的嘔吐和腹瀉，使體內水分和電介質大量丟失，形成嚴重的水樣腹瀉綜合征。霍亂弧菌造成的主要病變均由嚴重脫水引起，臨床可見指紋皺縮，皮下組織及肌肉幹癟。心、肝、脾等髒器均見縮小。內髒漿膜無光澤。腸腔高度擴張、腸內充滿泔水樣液體，腸粘膜鬆弛，但粘膜上皮完整，無潰瘍。膽囊內充滿粘稠膽汁。腎小球及間質的毛細管擴張，腎小管腫脹、變性及壞死。其他髒器也有出血、變性等變化。 

二、檢驗過程

  試驗參考標準為《SN/T 1022—2010 進出口食品中霍亂弧菌檢驗方法》。本標準規定了進出口食品中霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的檢驗方法，適用於食品中霍亂弧菌的檢驗，動物飼料和其他食品生產和加工區域環境樣品中的霍亂弧菌檢驗可參照使用。

  霍亂弧菌檢驗程序如圖1：

   圖1

  1.培養基鑒定及結果判斷

  ①TCBS培養基

  原理：蛋白腖、酵母浸粉提供碳氮源、維生素和生長因子；氯化鈉可刺激弧菌的生長；蔗糖是可發酵的糖類；牛膽酸鈉、牛膽粉、硫代硫酸鈉和枸櫞酸鈉及較高的pH 可抑製革蘭氏陽性菌和大腸菌群；硫代硫酸鈉與檸檬酸鐵反應作為檢測硫化氫產生的指示劑；溴麝香草酚藍和麝香草酚藍是pH指示劑；瓊脂是培養基的凝固劑。

  使用方式：稱取本品89g，煮沸溶解於1000ml蒸餾水中，冷至45-50℃時，傾入無菌平皿，備用。注：無需高壓滅菌。

  結果：霍亂弧菌在TCBS上呈圓形，表麵光滑，黃色，直徑2mm～3mm，具體試驗結果如圖2：

圖2 霍亂弧菌非01 TCBS培養基生長結果

  ②慶大黴素瓊脂培養基

  原理：蛋白腖、牛肉浸粉提供氮源、維生素、礦物質和生長因子；蔗糖提供碳源；氯化鈉即用於滿足霍亂弧菌嗜鹽生長的要求，同時形成了不利於其他細菌生長的高滲透壓；亞硫酸鈉可刺激弧菌生長；慶大黴素和亞碲酸鉀及較高的pH值，可抑製革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性雜菌的生長；枸櫞酸鈉可使得霍亂弧菌免受其他抑菌物質的影響；霍亂弧菌對酸性環境比較敏感，因此該pH 值可促進其生長；瓊脂是培養基的凝固劑。

  使用方式：稱取本品56.0g，加熱攪拌溶解於1000ml蒸餾水中，冷至50℃左右時，加入無菌1%亞碲酸鉀溶液0.5ml，混勻，傾入無菌平皿，備用。無需高壓滅菌。

  結果：霍亂弧菌在慶大黴素瓊脂培養基上略帶青灰色，半透明，扁平微隆起，如延長培養或室溫放置，菌落中心形成黑色金屬碲沉澱，具體試驗結果如圖3：

菌落略帶青灰色，半透明，扁平微隆起	菌落中心形成黑色金屬碲沉澱

圖3 霍亂弧菌非01慶大黴素瓊脂培養基生長結果

  ③氯化鈉三糖鐵瓊脂

  原理：蛋白腖、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳氮源、維生素和礦物質；乳糖、葡萄糖、蔗糖為可發酵糖類，其被分解產酸時通過苯酚紅酸堿指示劑測出，酸性呈黃色，堿性呈紅色；因某些細菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氫，硫化氫和培養基中的鐵鹽反應生成黑色的硫化亞鐵沉澱；較高含量的氯化鈉可促進弧菌的生長；瓊脂是培養基的凝固劑。

  使用方式：稱取本品69.5g，加入1000ml蒸餾水中，加熱煮沸使完全溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌15分鍾，備用。

  結果：霍亂弧菌在氯化鈉三糖鐵斜麵上的反應為底層黃色，斜麵黃色，不產生硫化氫，不產氣，具體試驗結果如圖4：

圖4 氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵試驗結果

  ④氯化鈉營養瓊脂

  原理：蛋白腖、牛肉浸粉提供微生物生長所需的碳氮源、維生素和生長因子；高含量的氯化鈉可促進霍亂弧菌的生長；瓊脂是培養基的凝固劑。

  使用方式：稱取本品36.0g，加熱溶解於1000ml蒸餾水中，分裝三角瓶或試管，121℃高壓滅菌15min，備用。

  結果：霍亂弧菌在氯化鈉營養瓊脂培養基上純化培養後菌落呈圓形，邊緣半透明中央不透明，直徑為3mm左右，具體試驗結果如圖5：

圖5 霍亂弧菌非01氯化鈉營養瓊脂培養基生長結果

  2.生化鑒定及結果判斷

  ①革蘭氏染色

  所用試劑：革蘭氏染色液試劑盒。

  原理：通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的複合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密，遇乙醇或丙酮脫色處理時，因失水反而使網孔縮小，再加上它不含類脂，因此，能把結晶紫與碘複合物牢牢留在壁內，使其仍呈紫色；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差，在遇脫色劑後，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘複合物的溶出，因此通過乙醇脫色後仍呈無色，再經沙黃等紅色染料複染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

  結果：霍亂弧菌為革蘭氏陰性菌，呈弧形或彎曲狀，染色結果如圖6：

圖6 霍亂弧菌革蘭氏染色結果

  ②氧化酶試驗

  所用試劑：氧化酶試紙。

  原理：氧化酶亦即細胞色素氧化酶，為細胞色素呼吸酶係統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素c氧化，然後此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化，產生顏色反應。用細玻璃棒或一次性接種針挑取單個菌落，塗在試紙上。在30s內變為藍色或藍紫色為陽性，不變色為陰性。

  結果：挑選營養瓊脂上純培養的單個菌落進行氧化酶試驗，霍亂弧菌為氧化酶陽性，試驗結果如圖7：

a:陰性試驗結果；b:霍亂弧菌非01

圖7 氧化酶試驗結果

  ③生化鑒定條試驗

  所用試劑：青島betway必威西汉姆联HBI霍亂弧菌生化鑒定條（SN）。

  試劑介紹：用於霍亂弧菌的生化鑒定。組成：ONPG、尿素酶、明膠、精氨酸雙水解酶肉湯、鳥氨酸脫羧酶肉湯、賴氨酸脫羧酶肉湯、氨基酸脫羧酶對照、無鹽胰腖水、2%氯化鈉胰腖水、6%氯化鈉胰腖水、8%氯化鈉胰腖水、10%氯化鈉胰腖水、靛基質、1%氯化鈉乳糖、1%氯化鈉纖維二糖、1%氯化鈉阿拉伯糖、1%氯化鈉蔗糖、1%氯化鈉甘露糖、42℃生長試驗。(SN標準)。

  操作過程：取一內盛2ml無菌生理鹽水試管，用接種針從氯化鈉營養瓊脂平板上挑取部分菌落至無菌生理鹽水中，仔細研磨製成0.5麥氏濁度的均一細菌懸液，取一無汙染的生化鑒定條，每孔加入100ul菌懸液，其中固體和半固體生化管采用穿剌接種，鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸和氨基酸對照需加滅菌石蠟覆蓋液麵。接種完後做好標記，蓋上蓋子，放入底托中，放置36℃±1℃培養（42℃生長置42℃培養）。培養結束後，記錄試驗結果。具體試驗結果如圖8：

圖8 霍亂弧菌非01生化鑒定條結果

霍亂弧菌非01生化鑒定結果表

  注意事項：1.靛基質試驗過程中，在培養結束後需加Kovacs氏靛基質試劑2-4滴，混勻後4h內觀察結果；2.鳥氨酸、精氨酸、賴氨酸和氨基酸對照需加滅菌液體石蠟覆蓋液麵。

三、結果總結

  霍亂弧菌在TCBS上呈圓形，表麵光滑，黃色，直徑2mm～3mm；在慶大黴素瓊脂培養基上略帶青灰色，半透明，扁平微隆起，如延長培養或室溫放置，菌落中心形成黑色金屬碲沉澱；在氯化鈉三糖鐵斜麵上的反應為底層黃色，斜麵黃色，不產生硫化氫，不產氣；在氯化鈉營養瓊脂培養基上純化培養後菌落呈圓形，邊緣半透明中央不透明，直徑為3 mm左右；經革蘭氏染色試驗鑒定為革蘭氏陰性，呈弧形或彎曲狀；在氧化酶試紙上呈紫色，為陽性實驗結果；在無鹽蛋白腖腖水和2%氯化鈉蛋白腖水中生長；6%氯化鈉蛋白腖水、8%氯化鈉蛋白腖水生長旺盛為陽性和10%氯化鈉蛋白腖水中不生長；ONPG為陽性；尿素酶為陰性；明膠為陽性；鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶陽性；氨基酸對照和精氨酸為陰性；蔗糖、甘露醇為陽性；乳糖、纖維二糖和阿拉伯糖為陰性；靛基質試驗為陽性；在42℃恒溫培養箱中生長。除上述試驗，對霍亂弧菌的檢測亦可選做血清學分型等相關試驗。

  注：本文屬betway必威西汉姆联生物原創，未經允許不得轉載。

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