一、大腸埃希氏菌簡介
大腸埃希氏菌（Escherichia coli）又稱大腸杆菌，廣泛存在於人和溫血動物的腸道中，能夠在44.5℃發酵乳糖產酸產氣，IMViC（靛基質、甲基紅、VP試驗、檸檬酸鹽）生化試驗結果為＋＋－－或－＋－－的革蘭氏陰性杆菌。以此作為糞便汙染指標來評價食品的衛生狀況，推斷食品中腸道致病菌汙染的可能性。
二、參考標準
《GB 4789.38-2012 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌計數》。
三、檢驗流程
（一）MPN法
圖1 大腸埃希氏菌MPN計數法檢驗程序
1.初發酵試驗
每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36±1℃培養24±2h，觀察小倒管內是否有氣泡產生，24±2h產氣者進行複發酵試驗，如未產氣則繼續培養48±2h。產氣者進行複發酵試驗。如所有LST肉湯管均未產氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結果。
根據標準菌株對月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯進行驗證。大腸菌群、大腸杆菌和發酵乳糖的革蘭氏陰性細菌產生氣體，在小倒管內有氣泡；其它細菌無氣泡。結果如圖2所示：
a:鼠傷寒沙門氏菌 b:大腸埃希氏菌 c:弗氏檸檬酸杆菌 d:陰溝腸杆菌 e:糞腸球菌 f:空白對照
圖2 月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯微生物質控結果
2.複發酵試驗
用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種於已提前預溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的44.5±0.2℃水浴箱內。水浴的水麵應高於肉湯培養基液麵，培養24±2h，檢查小倒管內是否有氣泡產生，如未有產氣則繼續培養至48±2h。記錄在24h和48h內產氣的EC肉湯管數。如所有EC肉湯管均未產氣，即可報告大腸埃希氏菌MPN結果；如有產氣者，則進行EMB平板分離培養。
根據標準菌株對EC肉湯進行驗證。糞大腸菌群和大腸杆菌產生氣體，在倒立小發酵管中有氣泡。結果如圖3所示：
a:大腸埃希氏菌菌 b:鼠傷寒沙門氏菌 c:弗氏檸檬酸杆菌 d:陰溝腸杆菌 e:肺炎克雷伯氏菌 f:空白對照
圖3 EC肉湯微生物質控結果
3.伊紅美藍（EMB）平板分離培養
輕輕振搖各產氣管，用接種環取培養物分別劃線接種於EMB平板，36±1℃培養18～24h。觀察平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
根據標準菌株對EMB培養基進行驗證。典型大腸埃希氏菌菌落特征為具黑色中心有金屬光澤，產氣腸杆菌為粉紅色菌落無光澤，鼠傷寒沙門氏菌為無色菌落。結果如圖4所示：
a:大腸埃希氏菌 b:產氣腸杆菌 c:鼠傷寒沙門氏菌
圖4 EMB培養基微生物質控結果
4.革蘭氏染色
挑取營養瓊脂培養基上的純培養的單個可疑菌落，進行革蘭氏染色。大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞杆菌，呈紅色杆狀。結果如圖5所示：
圖5 大腸埃希氏菌的革蘭氏染色結果
5.生化鑒定
取培養物進行靛基質試驗、甲基紅試驗、VP試驗和檸檬酸鹽利用試驗，可選取使用大腸杆菌生化鑒定條進行生化鑒定，大腸埃希氏菌的生化反應結果為靛基質陽性、甲基紅陽性、VP陰性、檸檬酸鹽陰性。如圖6所示：
圖6 大腸埃希氏菌生化鑒定條試驗結果
6.結果判定
大腸埃希氏菌為革蘭氏陰性無芽胞杆菌，發酵乳糖、產酸、產氣，IMViC生化試驗為＋＋--或-＋--。隻要有1個菌落鑒定為大腸埃希氏菌，其所代表的LST肉湯管即為大腸埃希氏菌陽性。依據LST肉湯陽性管數查MPN表，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌MPN值。
（二）平板計數法
圖7 大腸埃希氏菌平板計數法檢驗程序
1.平板計數
取2～3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種2個無菌平皿， 每皿1mL。同時取1mL稀釋液加入無菌平皿做空白對照。
將10～15 mL 冷至45±0.5℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固後，再加3～4 mL VRBA-MUG覆蓋平板表層。凝固後翻轉平板，36±1℃培養18～24 h。
根據標準菌株對VRBA培養基進行驗證，大腸埃希氏菌為紫紅色菌落，有膽鹽沉澱環；在紫外燈照射下有熒光。結果如圖8所示：
a;大腸埃希氏菌 b;弗氏檸檬酸杆菌 c;陰溝腸杆菌
圖8 VRBA培養基微生物質控結果
注意事項：選擇菌落數在10～100CFU之間的平板，暗室中360～366nm波長紫外燈照射下，計數平板上發淺藍色熒光的菌落。
2.結果判定
兩個平板上發熒光菌落數的平均數乘以稀釋倍數，報告每g（mL）樣品中大腸埃希氏菌數，以CFU/g(mL)表示。若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小於1乘以最低稀釋倍數報告。
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