1、蛋白腖稀釋液的製備:
將1g蛋白腖(細菌蛋白腖除外)溶於1000ml去離子水中，用鹽酸調節pH至7.0，滅菌溫度為121℃。時長15分鍾。
2、微量元素溶液製備:
微量元素水溶液營養成分的組成如表1所示
表1.微量元素溶液組成
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微量元素 |
濃度 |
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氯化鈉 |
10mg/ml |
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七水硫酸亞鐵 |
18mg/ml |
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一水硫酸錳 |
16mg/ml |
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七水硫酸鋅 |
1.6mg/ml |
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五水硫酸銅 |
1.6mg/ml |
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七水硫酸鈷 |
1.6mg/ml |
3、液化GYE瓊脂培養基的製備:
營養成分的組成如表2所示
表2.液化GYE瓊脂培養基營養成分的組成
試劑
數量
酵母提取物粉末
5.0g
蛋白腖
5.0g
葡萄糖
5.0g
磷酸氫二鉀(K2HP04)
0. 5g
磷酸二氫鉀(KH2P04)
0. 5g
硫酸鎂
0.3g
微量元素
1.0ml
水
1000.0ml
使用乳酸溶液調節上述營養成分混合液pH到6.3。將混合液轉移到大錐形瓶中，向錐形瓶中加入15.0g瓊脂。使用鋁箔包裹錐形瓶，將其放置於加熱板上進行加熱，並攪摔，直到瓊脂完全溶解。隨後在高壓滅菌鍋中在121℃下進行至少15分鍾滅菌。待高壓滅菌鍋可以安全打開時，將錐形瓶放置於50℃的水浴中。
4、樣品準備
4.1 食品取樣
稱取25g樣品，置於無菌均質袋中，加225ml滅菌蛋白腖水，拍擊式均質器均質至完全溶解於蛋白腖水，混勻。
注:若樣品不能完全溶於蛋白腖水，需要將蛋白腖水預熱至50C再加入樣品，或加入樣品後將混合懸浮液置於50℃預熱5min,直至樣品完全溶解。
4.2 檢查混合懸浮液pH值。若pH小於7.0，用氫氧化鈉(5N)溶液調節pH至8.5±0.2;若pH大於8.7，用鹽酸溶液(5N)調節pH至8.5±0.2。
4.3 樣品移取20-30ml均質懸浮液於50ml離心管中於75℃水浴30min,立即冷卻至45℃以下，然後移液。
4.4 移取1.0ml該液於9.0ml滅菌蛋白腖水的試管中，渦旋徹底混勻(10-2稀釋管即得)。
4.5 根據要求重複操作。所做稀釋度及平板培養所用稀釋度應隨預期孢子數變化而變化。
注1:將每個稀釋度溶液混勻，然後移液;
注2:步驟4.3:將離心管置於水浴後立即開啟計時器。
5、平板培養
5.1 液化GYE瓊脂培養基，然後置於水浴中冷卻至50℃以下(該培養基容易凝固，要置於50℃左右的水浴鍋內) ;每個稀釋度準備兩個無菌培養皿。分別從最後兩個稀釋管溶液中加1.0ml於相應編號的培養皿中，然後將15至20ml的熔融培養基倒至各個培養皿，徹底混勻。待固化時，將平板翻轉，40℃+2℃培養48小時，同時準備一個隻包含瓊脂培養基及一個隻含有1.0ml蛋白腖稀釋液和瓊脂培養基作為陰性對照。
6、平板計數
菌落數在30至300之間的平板計數最為理想。平板計數隻記錄滿足以下條件的菌落:瓊脂表麵的菌落需要直徑為1mm到5mm;白色到奶色，凸麵，具有完整的邊緣和光滑的表麵。嵌在瓊脂培養基中的菌落需要直徑為0. 5mm-1mm在瓊脂中具有奶色的點狀體。
6.1 若隻有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數範圍內,計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g(ml)樣品中菌落總數結果。
6.2 若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數範圍內時，按公式(1)計算:
N= ∑C/ (n1+0.1n2)d........................ (1)
式中:
N-樣品中菌落數:
∑C - 平板(含適宜範圍菌落數的平板)菌落數之和:
n1 - 第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數;
n2 - 第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數;
d - 稀釋因子(第一稀釋度)。
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