一、支原體簡單介紹
1.形態特征
支原體是一類沒有細胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養基培養增殖的最小原核細胞型微生物，大小為0.1-0.3微米。由於能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。
2.生化分型
常利用發酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反應鑒別支原體。 一般能分解葡萄糖的支原體則不能利用精氨酸，如肺炎支原體；能利用精氨酸的支原體則不能分解葡萄糖，如口腔支原體、人型支原體；解脲支原體不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。
3.培養特性
支原體對營養需求較高，一般需要在培養基中添加一定比例的動物血清，大多數兼性厭氧，有些菌株在初分離時加入5%CO2生長更好。支原體生長緩慢，在瓊脂含量較少的固體培養基上培養會出現典型的“荷包蛋樣”，核心部分較厚，向下長入培養基，周邊為一層薄的透明顆粒區。
4.抵抗力
支原體對熱的抵抗力與細菌相似。對環境滲透壓敏感，滲透壓的突變可致細胞破裂。對重金屬鹽、石炭酸、來蘇爾和一些表麵活性劑較細菌敏感，但對醋酸鉈、結晶紫和亞銻酸鹽的抵抗力比細菌大。對影響細胞壁合成的抗生素如青黴素不敏感。
二、 二、口腔支原體檢驗依據及原理
支原體廣泛存在於人和動物體內，是生物製品細胞培養生產工藝中常見的汙染物，2020年版《中華人民共和國藥典》要求使用精氨酸支原體培養基培養檢測口腔支原體。具體操作要求為：將口腔支原體稀釋至10-3-10-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養基內，每個稀釋度接種3支試管，置36℃培養7-14天，觀察培養基變色結果。口腔支原體可以利用培養基中的精氨酸，使培養基pH值升高，遇指示劑酚紅使培養基變紅。培養基中的豬胃消化粉、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳源、氮源、生長因子，氯化鈉維持滲透壓，酚紅為酸堿指示劑。
三、培養基配方（g/L）：
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豬胃消化粉 |
10.0 |
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牛肉浸粉 |
5.0 |
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酵母浸粉 |
5.0 |
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氯化鈉 |
2.5 |
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葡萄糖 |
1.0 |
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L-精氨酸 |
2.0 |
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酚紅 |
0.02 |
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pH值7.1±0.2（25℃） |
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四、口腔支原體固體平板法的具體操作步驟及培養結果
1.液體培養基活化
吸取保存的口腔支原體原液100uL，加入到精氨酸支原體肉湯培養基中，封口膜纏住管口，37度需氧培養3-4天，可發現培養管澄清且變紅。說明有支原體生長且無雜菌汙染。如下圖所示：
口腔支原體液體培養結果
2.固體培養基二次活化
吸取經過初次活化的支原體培養液100uL,塗布於精氨酸支原體固體培養基平板上，封口膜包住平板邊緣，37度培養6-10天，直到在光線下可以看到如下圖所示的針尖大小的菌落。
口腔支原體固體培養結果
五、口腔支原體常規切片觀察
用消毒的小刀切割下一小塊瓊脂塊，放於載玻片上，低倍鏡下觀察，可看到支原體呈現典型的"荷包蛋樣"菌落，核心部分較厚，向下長入培養基，周邊為一層薄的透明顆粒區。
口腔支原體切片觀察
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口腔支原體鏡檢結果觀察（低倍鏡） |
口腔支原體鏡檢結果觀察（高倍鏡） |
六、口腔支原體染色步驟及鏡檢結果
為了增加顏色的對比度，更好的觀察檢測支原體，可采用加染色液的方式對支原體進行染色。中國藥典采用的為指示細胞培養法即DNA染色法，需要借助特殊的熒光染料和熒光顯微鏡進行觀察。而一般的實驗室並不具備這樣的條件，因此可以使用一種更為簡單的染色方法，借助兩種常見的染液及普通電子顯微鏡即可觀察。具體步驟為：將蕃紅染液或結晶紫染液稀釋10倍左右，直接加入到平板上染色10秒，之後用水衝洗掉，用小刀切割一塊瓊脂塊上顯微鏡觀察，可看到如下圖所示，染色使支原體更加清晰，明顯。下圖分別為蕃紅染色和結晶紫染色結果。
口腔支原體蕃紅染色結果
口腔支原體結晶紫染色結果（低倍鏡）
口腔支原體結晶紫染色結果（高倍鏡）
七、整個操作過程中的注意事項
1.染液必須要稀釋，且染色時間不易過長，否則染色太深，觀察效果不好。
2.平板可以倒薄一些，這樣切割下來的瓊脂塊會比較薄，便於光線的透過，觀察起來也會更加清晰明亮。
3.不建議用菌液直接滴加到載玻片上，因為菌液本身含菌量太少，實測含菌量一般低於103/mL，因此難以快速發現支原體，且支原體為無色，與培養液混合後更難以在顯微鏡鏡下找到。
4.固體培養基加血清倒板後，一定注意整個平板要完全透明無氣泡無雜質，如果平板狀態不好，會對後期結果的觀察造成幹擾。
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