專性厭氧菌的培養方法及注意事項

一、專性厭氧菌的介紹

  根據細菌生長對氧的需求，主要可分為四大類：專性需氧菌、兼性厭氧菌、專性厭氧菌、微需氧菌。

  專性厭氧菌需要在嚴格無氧的氣體環境中生長，氧氣會對菌產生毒害作用，也有一些厭氧菌在含5%-10%二氧化碳氣體環境中可耐受低濃度的氧氣。常見的專性厭氧菌有梭菌屬（如產氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、破傷風梭菌、艱難梭菌等）、雙歧杆菌屬（如嬰兒雙歧杆菌、動物雙歧杆菌等）、擬杆菌屬、梭杆菌屬、厭氧消化鏈球菌屬等。

二、厭氧培養環境的構造

  （1）使用厭氧培養箱，通氣培養。一些厭氧培養箱可同時進行接種等微生物操作，並直接進行培養，操作方便，成功率高，缺點是多數實驗室不具備，損耗較大，對於小規模的培養試驗來說，成本較高。

  （2）使用厭氧罐、厭氧盒或厭氧培養袋+厭氧產氣包，可製作小型或中型空間的厭氧環境，操作方便，不需要任何複雜的專門設備，可在所有實驗室中使用，非常適合實驗室中小規模的試驗操作。

注意事項：培養基必須與厭氧環境氣體流通，如使用試管、錐形瓶等容器培養，必須確保塞子透氣；培養平皿時，必須保證平皿的透氣性良好，不能使用封口膜密閉纏繞。

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  （3）液體培養基可采用覆蓋石蠟隔絕氧氣的方法，如皰肉培養基、梭菌增菌培養基等，在培養基配製完成分裝後，在培養基上方覆蓋約0.5-1cm厚度的液體石蠟，再進行滅菌處理，可直接進行厭氧菌的培養，無需使用厭氧培養箱或厭氧罐等設備。

  注：在滅菌前覆蓋石蠟，滅菌過程中培養基中溶解的氧氣會逸出，冷卻後石蠟會阻隔空氣中氧氣的進入，可以更好的製造厭氧環境；培養基中也可補加一定量的還原性鐵粉或硫乙醇酸鈉、半胱氨酸等還原性成分，幫助維持厭氧環境。

  （4）有些培養基可自然的形成厭氧環境，無需厭氧培養，如硫乙醇酸鹽流體培養基，靜置過程會自發分層，下層為無氧環境，無需任何厭氧設備，也無需覆蓋液體石蠟，即可培養厭氧菌。

三、常見厭氧菌的培養基

1.硫乙醇酸鹽流體培養基

  此培養基常用於梭菌的活化及增菌培養，也可對營養成分進行改良用於一些營養要求較高的厭氧菌的培養，此培養基可自然的形成厭氧環境，無需厭氧培養，此培養基靜置過程會自發分層，下層為無氧環境，無需任何厭氧設備，也無需覆蓋液體石蠟，即可培養厭氧菌。

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2.皰肉培養基

  相比較於硫乙醇酸鹽流體培養基，此培養基需覆蓋液體石蠟，用於培養梭菌時，可以存活更長時間（如生孢梭菌，在硫乙醇酸鹽流體培養基中隻能存活數天，而在皰肉培養基中可存活數月以上）。

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3.GAM/改良GAM培養基

  此培養基營養非常豐富，適用於絕大多數的厭氧菌培養，特別是用於比較難培養的營養苛求型細菌（如擬杆菌屬）。

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4.血平板/CDC厭氧菌瓊脂

  營養豐富，適用於絕大多數厭氧菌的培養（梭菌、擬杆菌等均可培養）。

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5.MRS瓊脂/肉湯

  用於雙歧杆菌的培養，製備好的MRS肉湯培養基澄清透明無沉澱，常用於乳酸菌或雙歧杆菌的活化、增菌及收集菌體。

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四、注意事項

  （1）培養基的製備

  需覆蓋石蠟的液體培養基，應在滅菌前完成分裝並覆蓋液體石蠟；流體培養基或半固體培養基在有氧條件下培養厭氧菌時，使用前可采用沸水浴或其他除氧方式排出培養基內溶解的氧氣.

  （2）操作過程

  因氧氣會對厭氧菌產生毒害作用，因此整個操作過程應在專門的無氧設備中進行。如在正常空氣中操作，從厭氧菌暴露在空氣中開始到放入厭氧環境中培養結束，整個過程應盡可能快速操作，一般不超過15分鍾，暴露時間越長，厭氧菌越容易死亡。

  （3）培養環境

  可采用厭氧罐、厭氧培養箱、厭氧產氣包等方式提供厭氧環境，除了確保氣體環境無氧之外，有些厭氧菌通常還需要5%-10%的二氧化碳、氫氣等氣體促進生長並提高厭氧菌對氧氣的耐受性，更容易培養成功。

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