一、參考標準
《GB4789.44-2020食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 創傷弧菌檢驗》點擊下載
二、簡介
1、生物學特征：創傷弧菌（Vibrio vulnificus）是一種海洋弧菌。形態：革蘭氏陰性弧菌，在液體培養基中菌體大小為0.7*2-3 μm，稍彎曲；在固體培養基中呈多樣性，有極端單鞭毛。培養特性：營養要求一般，最適生長溫度為30℃，兼性厭氧；在無NaCl及超過8%NaCl的培養基中不生長，可在0.5%NaCl及3%NaCl的蛋白腖水中生長，在含6%NaCl的蛋白腖水中生長良好。
2、流行病學特點：創傷弧菌廣泛分布在海水中，可從牡蠣等海產品中分離得到。本菌主要通過傷口接觸海水造成感染，也可經口感染。經傷口感染時可導致蜂窩織炎及骨髓炎等多種炎症，經口感染時常迅速導致菌血症或敗血症。感染本菌後如不及時治療，病死率很高。
三、檢驗程序
四、操作步驟
1.樣品製備
以無菌操作取處理後的樣品25g，加入蛋白腖-氯化鈉-纖維素二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液225mL，用均質器均質2min，充分混勻製備成1:10的樣品勻液。
注意：新鮮樣品采集後應於3h內完成檢驗，若不能在規定時間內完成，則將樣品置於7℃-10℃條件下保存（因創傷弧菌在4℃條件下極易形成活而不可培養的狀態，因此樣品勿放4℃條件下），並盡可能在24h內完成檢驗；冷凍樣品應在不超過45℃的溫熱條件下解凍，解凍時間不超過15min。
2.增菌
將製備的1:10樣品勻液於36℃±1℃培養18h±1h。結果如圖2所示：
圖2 PNCC增菌液培養結果
3.PCR檢測
4.分離
用10μL接種環在距離PNCC增菌液的液麵下1cm沾取一環增菌液，分別劃線接種於纖維素二糖-多黏菌素E（CC）和改良纖維二糖-多黏菌素B-多黏菌素E（mCPC）瓊脂培養基平板，於36℃±1℃條件下培養18h±1h。
典型的創傷弧菌可以發酵纖維二糖產酸使培養基變黃，所以在CC和mCPC平板上的形態為：圓形、扁平，光照下呈透明或中心不透明但邊緣透明的黃色至橘黃色菌落，菌落直徑1mm~2mm，菌落周圍可出現（或不出現）黃色暈圈。結果如圖3所示：
圖3 創傷弧菌CICC 10383在CC和mCPC瓊脂培養基平板上的培養結果
5.分純培養
從CC平板和mCPC平板上各挑取至少5個創傷弧菌可疑菌落（少於5個時全選），分別接種於3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板，36℃±1℃培養18h±1h後用於後續鑒定。
創傷弧菌在3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上的菌落形態為：圓形、乳白色、濕潤、隆起、直徑1mm~2mm。結果如圖4所示：
圖4 創傷弧菌CICC 10383在3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上的培養結果
6.鑒定
創傷弧菌可采用菌落特征結合生化特性或PCR方法進行鑒定。
6.1 菌落特征及生化特性
6.1.1 初步鑒定
該步驟用於創傷弧菌的初步鑒定，進行以下4項鑒定實驗時，挑取的菌落應來自分純後的同一個單菌落。
（1）革蘭氏染色鏡檢：從分純培養的3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上挑取創傷弧菌疑似菌落進行革蘭氏染色鏡檢。
創傷弧菌為革蘭氏陰性，顯微鏡下菌體為棒狀、弧狀、卵圓狀等多種形態，無芽胞，如圖5所示：
圖5 革蘭氏染色結果
（2）氧化酶試驗：用接種環挑取從分純培養的3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上挑取創傷弧菌疑似菌落適量塗在蒸餾水潤濕的氧化酶試紙上，在10 s內變為藍色或藍紫色為陽性，2 min內不變色為陰性。
創傷弧菌在氧化酶試紙上顯藍色，為陽性。結果如圖6所示：
圖6 氧化酶試驗結果
注：a：創傷弧菌CICC 10383；b：大腸埃希氏菌ATCC 25922
（3）三糖鐵試驗：用接種針從分純培養的3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上挑取創傷弧菌疑似菌落適量，轉種於3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵並穿刺底層（注意接種針不要觸及試管底部），36℃±1℃培養24h，觀察結果。
創傷弧菌可以發酵葡萄糖產酸不產氣，使斜麵變黃，但因接觸空氣而氧化，加之細菌生長利用培養基中含氮物質，生成堿性產物，故斜麵後來又變紅。底部由於厭氧狀態，酸類不被氧化，仍保持黃色。所以在3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵中生長時試管底層變黃，無氣泡，斜麵顏色不變黃。結果如圖7所示：
圖7 3%氯化鈉三糖鐵瓊脂培養結果
注：a：空白對照；b：創傷弧菌CICC 10383
（4）嗜鹽性試驗：用接種針從分純培養的3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上挑取創傷弧菌疑似菌落分別接種於含有0%、3%、6%、8%、和10%氯化鈉的胰蛋白腖水中，36℃±1℃培養24h，觀察液體的混濁情況。
創傷弧菌在含有0%、8%、和10%氯化鈉的胰蛋白腖水中不生長或微弱生長，胰蛋白腖水澄清透亮或稍混濁，而在3%和6%氯化鈉的胰蛋白腖水中生長旺盛，胰蛋白腖水混濁。結果如圖8所示：
圖8 胰蛋白腖水培養結果
6.1.2 確證實驗
將初步鑒定為創傷弧菌的疑似菌落接種在3%氯化鈉胰蛋白腖大豆瓊脂平板上，36℃±1℃培養18h±1h後，取純培養物分別接種於含3%氯化鈉的賴氨酸脫酸酶試驗培養基和MR-VP培養基中，36℃±1℃培養24h~48h後觀察結果；
另取少許純培養物接種於3%氯化鈉三糖鐵瓊脂斜麵，36℃±1℃培養18h後用於ONPG試驗。結果如圖9所示：
圖9 確證試驗結果
注：a：對照；b：創傷弧菌CICC 10383
7.結果與報告
根據菌落特征、生化特征或PCR鑒定結果，報告25g樣品中檢出或未檢出創傷弧菌。
相關標準:
GB 4789.44-2020 食品微生物學檢驗 創傷弧菌檢驗 點擊下載
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