一、試驗簡介
氧化酶又名細胞色素氧化酶、細胞色素氧化酶c或呼吸酶。通過氧化酶試驗可檢測細菌是否能產生該酶，主要用於腸杆菌科細菌與假單胞菌的鑒別，前者為陰性，後者為陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應。
二、試驗原理
氧化酶為細胞色素呼吸酶係統的終末呼吸酶，氧化酶先使細胞色素c氧化，然後此氧化型細胞色素c再使對苯二胺氧化，生成有顏色的化合物，從而表現為顏色反應。
三、試劑
1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二胺。
四、試驗方法
常用方法有以下幾種：
（1）菌落法：直接滴加試劑於被檢菌落上。具體操作為，取37℃培養20 h的斜麵培養物一支，將2～3滴試劑從斜麵上端滴下，並將斜麵略加傾斜，使試劑流經斜麵上的培養物。如係平板培養物，則可將試劑滴在菌落上。
（2）濾紙法：取一小塊潔淨濾紙，沾取少量菌，然後滴加試劑。
（3）試劑紙片法：將濾紙片浸泡於試劑中製成試劑紙片，刮取菌苔塗於試劑紙上。
其操作手法如圖1所示：
圖1 紙片法進行氧化酶試驗的操作手法
（4）拭子法：拭子應浸入試劑中，然後與可疑的分離菌落接觸，在10秒鍾內注意顏色的變化。
（5）試管法：取18-24 h的營養肉湯（4.5mL）新鮮細菌培養物。加入試劑（0.2mL），搖動試管，以確保混合物充分混合，觀察顏色變化。
五、試驗結果
細菌與試劑接觸後，在10秒內呈深紫色，為強陽性；於2min內呈現藍色者為陽性；陽性培養物大多數於半分鍾內出現強陽性反應，2min以後出現微弱或可疑反應均判為陰性結果。
為保證結果準確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希氏菌作陽性和陰性對照。
六、注意事項
（1）進行測試時，試劑可能會自動氧化，因此使用新鮮試劑至關重要。為保證試劑新鮮，從配製到使用不應超過一周。
（2）純化菌時，要選擇不含過多糖類的培養基，如營養瓊脂和胰蛋白酶大豆瓊脂。培養基中高濃度的葡萄糖會導致假陽性結果。
（3）如果被測微生物在含有染料的培養基上生長，則結果可能會異常。
（4）在將試劑添加到活性培養物中之前，請先將培養物進行傳代培養，因為某些試劑會殺死微生物。
（5）氧化酶測試有助於鑒定奈瑟菌以及鑒定和區分革蘭氏陰性杆菌。為了確定被測生物的革蘭氏反應和形態，應使用革蘭氏染色進行檢查。
（6）刮取菌苔一定要使用鉑金環、一次性塑料接種環或玻璃棒。使用包含鐵的環可能會導致假陽性結果。
（7）如果所用試劑或試劑條的敏感性較低，則可能會導致假陰性結果。
（8）試紙條上滴加無菌水時，以剛剛浸濕為宜。若加水太多，會影響反應效果，延長反應時間，或無顏色反應，造成假陰性（如圖2）。
左：10 uL 右：20 uL
圖2 不同用量的無菌水對氧化酶試驗結果的影響
（9）確保用於氧化酶測試的菌落菌齡為18至24小時。較老的菌落，則會導致反應較弱甚至不反應（如圖3）。
左：24h菌苔 右：2周菌苔
圖3 不同菌齡的菌苔對氧化酶試驗結果的影響
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