【原理】
將抗原或抗體致敏在膠乳微粒上,此膠乳即具有免疫學性質,稱為免疫膠乳,當致敏的抗原膠乳與相應抗體相遇時,在有電解質的條件下,抗原很快和抗體結合,從而膠乳微粒被動地凝集起來,稱為膠乳凝集試驗。
將待測抗原樣品中先加入一定量的抗體,反應一段時間,再加入抗原膠乳,先加入的兩種成分因是對應的而結合起來,抑製了抗原膠乳與抗體的凝集反應,稱為膠乳凝集抑製試驗。
用抗體致敏膠乳直接測定抗原的方法,稱為反向膠乳凝集試驗。
【成分】
聚苯乙烯膠乳
若幹ml
胰酶若
幹g
硼酸緩衝鹽水
若幹ml
炭疽杆菌抗血清
若幹ml
pH8.4甘氨酸緩衝液
若幹ml
人γ球蛋白
若幹mg
羧基聚苯乙烯膠乳
若幹ml
pH7.2磷酸鹽緩衝液
若幹ml
羊抗免IgG抗體
若幹mg
碳化二乙胺
若幹mg
【製法】
1.聚苯乙烯免疫膠乳的製備:上海第六人民醫院檢驗科曾對聚苯乙烯膠乳的製備、篩選以及致敏等問題作過詳細的介紹.現有商品出售可不必自行製備。以下例舉兩種方法製備免疫聚苯乙烯膠乳的方法。
(1)胰酶處理聚苯乙烯膠乳致敏炭疽抗血清:
①聚苯乙烯膠乳的處理:取10%聚苯乙烯膠乳1ml,加蒸水4ml稀釋成2%,再加pH8.2硼酸緩衝鹽水(BBS)12ml 和1%胰酶溶液2ml,充分混合,置45℃水浴中約18小時,7500rpm離心30分鍾,去上清,加pH8.2 BBS10ml,製成1%膠乳備用。
②將炭疽杆菌抗血清於56℃水浴中加溫30分鍾,用pH7.2磷酸鹽緩衝液稀釋為1:20,取0.2ml加在1ml上述胰酶處理的膠乳中,於56℃水浴中致敏2小時,再置於室溫下穩定4小時。
對照膠乳用正常血清按上述條件致敏。
③影響製備炭疽抗血清膠乳的因素:為了防止聚苯乙烯膠乳自凝現象的出現和提高對抗血清的吸附並減少免疫膠乳的非特異反應,聚苯乙烯膠乳用胰酶處理後再致敏。而胰酶處理的膠乳要於3天內使用,否則吸附血清的能力明顯下降;致敏溫度對製備理想免疫膠乳有明顯影響,以56℃水浴致敏30分鍾為宜,低於45℃則發生不同程度的自凝;致敏的抗血清濃度過大,免疫膠乳的敏感性下降,濃度過低,則發生自凝,因此選擇合適的致敏抗血清濃度甚為重要。
(2)直接致敏人IgG:類風濕因子(RF)是類風濕性關節炎患者血清中的一組異常的免疫球蛋白,能和IgG的FC部分呈特異性反應。將人IgG結合在膠乳微粒上,當與患者血清反應後,免疫膠乳即出現凝集反應,說明患者血清中有類風濕因子。
①致敏方法:取10%聚苯乙烯膠乳1ml,加0. 1mol pH8.4甘氨酸緩衝液4ml,作1：5稀釋;另將人γ球蛋白稀釋為12.5mg/ml,二者等量相加,混均,在室溫放置過夜,加0.1%疊氮鈉防腐，即成類風濕因子免疫膠乳製劑。
致敏膠乳不必洗滌,直接用於試驗。
②影響類風濕因子免疫膠乳質量的因素:致敏用的γ球蛋白量要合適，γ球蛋白濃度過高，免疫膠乳容易發生自凝,過低則檢出的敏感性下降；免疫膠乳穩定性的關鍵是甘氨酸緩衝液中不含NaCl,否則致敏後數天,免疫膠乳就出現自凝;在檢測樣品時,為了獲得良好結果,緩衝液中須含有0.85%NaCl;致敏時,pH8. 4的甘氨酸緩衝液比pH8.2效果好。
(2)羧基聚苯乙烯免疫膠乳的製備:羧基聚苯乙烯膠乳是以苯乙烯為基本單體,聚合反應的條件與聚苯乙烯膠乳基本相同,在反應的適當時機引入少量丙稀酸作為羧基的來源,通過聚合獲得羧基聚苯乙烯膠乳。
這種免疫膠乳,抗原或抗體是以化學鍵共價交聯在顆粒上的,這種化學結合比較牢固,而且結合的抗原或抗體量也比較多,特異性也較好,擴大了膠乳試驗的應用範圍。例如HCG-羧基膠乳,鏈球菌溶血素“O”-羧基聚苯乙烯膠乳等。關於製備免疫羧基聚苯乙烯膠乳的操作步驟,文獻報告均不夠詳細,總的來看,基本上采用兩步法,即第1步接“手臂”,第2步聯結抗原或抗體,今以製備羊抗兔IgG-羧基聚苯乙烯膠乳為例,將該法介紹如下。
1.接“手臂"：取10%羧基膠乳1ml,加 0.2mol pH7.2磷酸鹽緩衝液1ml，0.025molε氨基乙酸2ml和碳化二乙胺4mg,室溫下輕輕攪拌2小時.8000rpm離心30分鍾,去上清留沉澱。
2.聯結抗體：上述膠乳用0.1mol pH7.6磷酸鹽緩衝液恢複至原體，加入羊抗兔IgG抗體2mg和碳化二乙胺6mg,在4℃冬件下輕輕攪拌6小時以上，離心去上清,用0.13molpH8.2硼酸緩衝液(含0.85%NaCl)洗1次,用同樣緩衝液恢複至原體積,即製成了羊抗兔IgG抗體-羧基聚苯乙烯膠乳。
【用途】
膠乳凝集試驗因具有快速、簡便和敏感、特異等優點,目前已廣泛的用於各種抗原和抗體的檢測。
【注意事項】
1.膠乳懸液保存時,放在4～6℃冰箱中,不能放在低溫冰箱使之凍結。
2.本試驗易受pH的影響,在pH5.5～8.0的範圍內,膠乳顆粒易發生非特性凝集,使用的溶液pH在8.2～8.4較好。
3.每批試驗應設置陰性對照和陽性對照。
4.如用玻片法時還應注意:
①不能搖的時間太長,時間過長,因蒸發的關係懸液邊緣出現幹的凝膠,這容易誤判。一般於0.5～2分鍾而出現凝集。
②不能搖動太劇烈,有些反應形成的凝集比較脆弱,劇烈的搖動。會使已形成的凝集破壞。
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