一、蠟樣芽孢杆菌簡介
蠟樣芽孢杆菌為革蘭氏陽性杆菌，能形成芽孢，屬於需氧芽孢杆菌屬。菌體兩端較平整，芽孢不大於菌體寬度，位於中央或稍偏一端，無莢膜，有周生表毛，有活動能力，能運動。本菌生長溫度為25℃～37℃，最適溫度為30℃～32℃。在營養瓊脂平板上生長，菌落乳白色、不透明、邊緣不整齊，菌落邊緣呈擴散狀，近看似白蠟狀。在甘露醇卵磷脂多黏菌素瓊脂平板上，蠟樣芽孢杆菌菌落為紅色（表示不發酵甘露醇），環繞粉紅的暈（表示產生卵磷脂酶）；在血平板上，菌落周圍呈草綠色β-溶血，周圍透明，菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀；在肉湯中生長渾濁，有膜或壁環，振搖易乳化。本菌能分解麥芽糖、蔗糖、水楊苷和蕈糖，不分解乳糖、甘露醇、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、山梨醇，硫化氫、尿素試驗陰性，卵磷脂酶試驗陽性，能在24h內液化明膠，溶血、厭氧條件下發酵葡萄糖。
二、參考標準：
《GB 4789.14-2014 食品微生物學檢驗 蠟樣芽孢杆菌檢驗》
三、蠟樣芽孢杆菌平板計數法（第一法）
3.1 檢驗程序
蠟樣芽孢杆菌平板計數法檢驗程序見圖1。
圖1 蠟樣芽孢杆菌平板計數法檢驗程序
3.2 操作步驟
3.2.1 樣品處理
冷凍樣品應在45℃以下不超過15min或在2℃～5℃不超過18h解凍，若不能及時檢驗，應放於-10℃~-20℃保存；非冷凍而易腐的樣品應盡可能及時檢驗，若不能及時檢驗，應置於2℃～5℃冰箱保存，24h內檢驗。
3.2.2 樣品製備
稱取樣品25g，放入盛有225mL的PBS或生理鹽水的無菌均質杯內，用旋轉刀片式均質器以8000r/min～10000r/min均質1min～2min，或放入盛有225mL的PBS或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min。若樣品為液態，吸取25mL 樣品至盛有225mL PBS或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內可預置適當數量的無菌玻璃珠）中，振蕩混勻，作為1:10的樣品勻液。
3.2.3 樣品的稀釋
吸取3.2.2中1:10的樣品勻液1mL加到裝有9mL PBS或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻製成1:100的樣品勻液。跟據對樣品汙染狀況的估計，按上述操作，依次製成十倍遞增係列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。
3.2.4 樣品接種
根據對樣品汙染狀況的估計，選擇2個～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板，然後用無菌L棒塗布整個平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表麵有水珠，可放在25℃～50℃的培養箱裏幹燥，直到平板表麵的水珠消失。
3.2.5 分離、培養
3.2.5.1 分離
在通常情況下，塗布後，將平板靜置10min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養箱30℃±1℃培養1h，等樣品勻液吸收後翻轉平皿，倒置於培養箱，30℃±1℃培養24h±2h。如果菌落不典型，可繼續培養24h±2h再觀察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色（表示不發酵甘露醇），周圍有白色至淡粉紅色沉澱環（表示產卵磷脂酶）。培養結果如圖2所示。
圖2 蠟樣芽孢杆菌在MYP瓊脂平板上的培養結果
3.2.5.2 純培養
從每個平板（符合3.4.1.1要求的平板）中挑取至少5個典型菌落（小於5個全選），分別劃線接種於營養瓊脂平板做純培養，30℃±1℃培養24h±2h，進行確證實驗。在營養瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表麵粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴展狀，直徑為4mm～10mm。培養結果如圖3所示。
圖3 蠟樣芽孢杆菌在營養瓊脂平板上的培養結果
3.3 確定鑒定
3.3.1 染色鏡檢
挑取純培養的單個菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽孢杆菌為革蘭氏陽性芽孢杆菌，大小為（1μm~1.3μm）×（3μm~5μm），芽孢呈橢圓形位於菌體中央或偏端，不膨大於菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長鏈狀排列。染色結果如圖4所示。
圖4 蠟樣芽孢杆菌革蘭氏染色結果
3.3.2 生化鑒定
3.3.2.1 概述
挑取純培養的單個菌落，進行過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、V-P試驗、葡萄糖利用（厭氧）試驗、根狀生長試驗、溶血試驗、蛋白質毒素結晶試驗。蠟樣芽孢杆菌生化特征與其他芽孢杆菌的區別見表1。
表1 蠟樣芽孢杆菌生化特征與其他芽孢杆菌的區別
|
項目 |
蠟樣芽孢杆菌 Bacillus cereus |
蘇雲金芽孢杆菌 Bacillus thuringiensis |
蕈狀芽孢杆菌 Bacillus mycoides |
炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis |
巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium |
|
革蘭氏染色 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
過氧化氫酶 |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
|
動力 |
+/- |
+/- |
- |
- |
+/- |
|
硝酸鹽還原 |
+ |
+/- |
+ |
+ |
-/+ |
|
酪蛋白分解 |
+ |
+ |
+/- |
-/+ |
+/- |
|
溶菌酶耐性 |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
|
卵黃反應 |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
|
葡萄糖利用 （厭氧） |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
|
V-P試驗 |
+ |
+ |
+ |
+ |
- |
|
甘露醇產酸 |
- |
- |
- |
- |
+ |
|
溶血（羊紅細胞） |
+ |
+ |
+ |
-/+ |
- |
|
根狀生長 |
- |
- |
+ |
- |
- |
|
蛋白質毒素晶體 |
- |
+ |
- |
- |
- |
|
注：+表示90%～100%的菌株陽性；-表示90%～100%的菌株陰性；+/-表示大多數的菌株陽性；-/+表示大多數的菌株陰性 |
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3.3.2.2 動力試驗
用接種針挑取培養物穿刺接種於動力培養基中，30°C培養24h。有動力的蠟樣芽孢杆菌應沿穿刺線呈擴散生長，而蕈狀芽孢杆菌常呈“絨毛狀”生長。也可用懸滴法檢查。培養結果如圖5所示。
圖5 動力試驗結果
3.3.2.3 溶血試驗
挑取純培養的單個可疑菌落接種於TSSB瓊脂平板上，30°C±1℃培養24h±2h。蠟樣芽孢杆菌菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環或完全溶血環。蘇雲金芽孢杆菌和蕈狀芽孢杆菌呈現弱的溶血現象，而多數炭疽芽孢杆菌為不溶血，巨大芽孢杆菌為不溶血。培養結果如圖6所示。
圖6 蠟樣芽孢杆菌在TSSB瓊脂平板上的培養結果
3.3.2.4 根狀生長試驗
挑取單個可疑菌落按間隔2cm~3cm左右距離劃平行直線於經室溫幹燥1d~2d的營養瓊脂平板上，30°C±1℃培養24h~48h，不能超過72h。用蠟樣芽孢杆菌和蕈狀芽孢杆菌標準株作為對照進行同步試驗。蕈狀芽孢杆菌呈根狀生長的特征。蠟樣芽孢杆菌菌株呈粗糙山穀狀生長的特征。結果如圖7所示。
圖7 根狀生長試驗結果
3.3.2.5 溶菌酶耐性試驗
用接種環取純菌懸液一環，接種於溶菌酶肉湯中，36°C±1°C培養24h。蠟樣芽孢杆菌在本培養基（含0.001%溶菌酶）中能生長。如出現陰性反應，應繼續培養24h。巨大芽孢杆菌不生長。結果如圖8所示。
圖8 溶菌酶耐性試驗結果
3.3.2.6 蛋白質毒素結晶試驗
挑取純培養的單個可疑菌落接種於硫酸錳營養瓊脂平板上，30°C±1°C培養24h±2h，並於室溫放置3d~4d，挑取培養物少許於載玻片上，滴加蒸餾水混勻並塗成薄膜。經自然幹燥，微火固定後，加甲醇作用30s後傾去，再通過火焰幹燥，於載玻片上滴滿0.5%堿性複紅，放火焰上加熱（微見蒸氣，勿使染液沸騰）持續1min~2min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30s，傾去染液用潔淨自來水徹底清洗、晾幹後鏡檢。觀察有無遊離芽孢（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結晶體。如發現遊離芽孢形成的不豐富，應再將培養物置室溫2d~3d後進行檢查。除蘇雲金芽孢杆菌外，其他芽孢杆菌不產生蛋白結晶體。
3.3.2.7 其他生化鑒定結果結果如圖9和圖10所示。
圖9 過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、葡萄糖利用試驗、V-P試驗、甘露醇產酸試驗結果
圖10 酪蛋白分解試驗結果
3.3.3 生化分型（選做項目）
根據對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、澱粉水解、V-P試驗反應、明膠液化試驗，將蠟樣芽孢杆菌分成不同生化型別，見表2。
表2 蠟樣芽孢杆菌生化分型試驗
圖11 檸檬酸鹽利用試驗、澱粉水解試驗、明膠液化試驗結果
3.3.4 補充說明
在進行蠟樣芽胞杆菌的生化鑒定時，也可使用蠟樣芽胞杆菌生化鑒定條對其生化反應進行判斷，蠟樣芽胞杆菌生化鑒定條中包含了所有蠟樣芽胞杆菌生化鑒定所需培養基，方便快捷高效。鑒定條結果如圖12所示，“+”表示實驗結果力陽性，“-”表示實驗結果為陰性。
圖12 蠟樣芽胞杆菌生化鑒定條結果
3.4 結果計算
3.4.1 典型菌落計數和確認
3.4.1.1 選擇有典型蠟樣芽孢杆菌菌落的平板，且同一稀釋度3個平板所有菌落數合計在20CFU~200CFU之間的平板，計數典型菌落數。如果出現a）~f）現象按3.4.2.1中公式（1）計算，如果出現g）現象則按3.4.2.2中公式（2）計算；
a）隻有一個稀釋度的平板菌落數在20CFU~200CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；
b）2個連續稀釋度的平板菌落數均在20CFU~200CFU之間，但隻有一個稀釋度的平板有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
c）所有稀釋度的平板菌落數均小於20CFU且有典型菌落，應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；
d）某一稀釋度的平板菌落數大於200CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；
e）所有稀釋度的平板菌落數均大於200CFU且有典型菌落，應計數最高稀釋度平板上的典型菌落；
f）所有稀釋度的平板菌落數均不在20CFU~200CFU之間且有典型菌落，其中一部分小於20CFU或大於200CFU時，應計數最接近20CFU或200CFU的稀釋度平板上的典型菌落。
g）2個連續稀釋度的平板菌落數均在20CFU~200CFU之間且均有典型菌落。
3.4.1.2 從每個平板中至少挑取5個典型菌落（小於5個全選），劃線接種於營養瓊脂平板做純培養，30°C±1℃培養24h±2h。
3.4.2 計算公式
3.4.2.1 菌落計算公式（1）
式中：
T——樣品中蠟樣芽孢杆菌菌落數；
A——某一稀釋度蠟樣芽孢杆菌典型菌落的總數；
B——鑒定結果為蠟樣芽孢杆菌的菌落數；
C——用於蠟樣芽孢杆菌鑒定的菌落數；
d——稀釋因子。
3.4.2.2 菌落計算公式（2）
式中：
T——樣品中蠟樣芽孢杆菌菌落數；
A1——第一稀釋度（低稀釋倍數）蠟樣芽孢杆菌典型菌落的總數；
A2——第二稀釋度（高稀釋倍數）蠟樣芽孢杆菌典型菌落的總數；
B1——第一稀釋度（低稀釋倍數）鑒定結果為蠟樣芽孢杆菌的菌落數；
B2——第二稀釋度（高稀釋倍數）鑒定結果為蠟樣芽孢杆菌的菌落數；
C1——第一稀釋度（低稀釋倍數）用於蠟樣芽孢杆菌鑒定的菌落數；
C2——第二稀釋度（高稀釋倍數）用於蠟樣芽孢杆菌鑒定的菌落數；
1.1——計算係數（如果第二稀釋度蠟樣芽孢杆菌鑒定結果為0，計算係數采用1）；
d——稀釋因子（第一稀釋度）。
3.5 結果與報告
3.5.1 根據MYP平板上蠟樣芽孢杆菌的典型菌落數，按3.4中公式（1）、公式（2）計算，報告每g（mL）樣品中蠟樣芽孢杆菌菌數，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小於1乘以最低稀釋倍數報告。
3.5.2 必要時報告蠟樣芽孢杆菌生化分型結果。
四、蠟樣芽孢杆菌MPN計數法（第二法）
4.1 檢驗程序
蠟樣芽孢杆菌MPN計數法檢驗程序見圖13。
圖13 蠟樣芽孢杆菌MPN計數法檢驗程序
4.2 操作步驟
4.2.1 樣品處理
同3.2.1。
4.2.2 樣品製備
同3.2.2。
4.2.3 樣品的稀釋
同3.2.3。
4.2.4 樣品接種
取3個適宜連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），接種於10mL胰酪腖大豆多黏菌素肉湯中，每一稀釋度接種3管，每管接種1mL（如果接種量需要超過1mL，則用雙料胰酪腖大豆多黏菌素肉湯）。於30°C±1℃培養48h±2h。培養結果如圖14所示。
圖14 胰酪腖大豆多黏菌素肉湯培養結果
4.2.5 培養
用接種環從各管中分別移取1環，劃線接種到MYP瓊脂平板上，30°C±1°C培養24h±2h。如果菌落不典型，可繼續培養24h±2h再觀察。
4.2.6 確定鑒定
從每個平板選取5個典型菌落（小於5個全選），劃線接種於營養瓊脂平板做純培養，30°C±1°C培養24h±2h，進行確證實驗，見3.3。
4.3 結果與報告
根據證實為蠟樣芽孢杆菌陽性的試管管數，查MPN檢索表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中蠟樣芽孢杆菌的最可能數，以MPN/g（mL）表示。
相關標準：
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