一、檸檬酸杆菌簡介
檸檬酸杆菌（Citrobacter），革蘭氏陰性兼性厭氧菌。直杆菌、直徑約1.0μm，長2.0μm~6.0μm。有呼吸和發酵兩種代謝類型。氧化酶陰性，動力試驗、ONPG試驗陽性，能利用檸檬酸鹽，能夠液化明膠，DNA酶試驗和V-P試驗陰性。根據《伯傑氏細菌學分類手冊》，檸檬酸杆菌屬分為弗氏檸檬酸杆菌（C.freundii）、科氏檸檬酸杆菌（C.diversus）和無丙二酸鹽檸檬酸杆菌（C.amalonaticus）三個種。
二、參考標準；
《SN/T 2552.6-2010 乳與乳製品衛生微生物學檢驗方法 第6部分：檸檬酸杆菌檢驗》
三、檢測步驟及結果判斷
3.1 增菌
無菌稱取樣品100g，10g和1g各三份分別加入2000mL、250mL和100mL樣品稀釋瓶中，加入9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水（1:10稀釋），或者將樣品直接稱量到裝有9倍預熱到45℃的滅菌蒸餾水的樣品稀釋瓶中，振搖使樣品充分混勻，36℃±1℃培養18h～24h。
分別移取培養18h~24h的懸液各10mL加入90mL四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）中，36℃±1℃培養18h～24h。
四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）檢驗原理：
蛋白腖和牛肉粉提供碳源、氮源和維生素，滿足細菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；碳酸鈣能中和細菌產酸及吸收有毒的代謝產物；硫代硫酸鈉和四硫磺酸鈉結合可抑製腸道共生菌（四硫磺酸鈉是在培養基加入碘和碘化鉀時形成），而具有四硫磺酸鈉還原酶的細菌能在此培養基中繁殖；膽鹽和煌綠可抑製大腸群菌和其它革蘭氏陽性細菌。
四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）用法：
稱取本品93.55g，溶解於1050mL蒸餾水中，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15分鍾，臨用前加入20%碘液 20mL，0.1% 煌綠10mL，現配現用，不宜久置。培養結果如圖1所示：
圖1 弗氏檸檬酸杆菌在TTB中的培養結果
3.2 分離培養
輕輕混勻增菌液，每份增菌液用接種環接種沙門氏菌誌賀氏菌分離瓊脂（SS）平板、亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板。采用三區法或四區法劃線，以獲得單個菌落。將平板倒置於36℃±1℃，SS瓊脂平板培養18h～24h，BS瓊脂平板培養40h～48h。
從SS平板和BS平板上分別挑取3個~5個可疑菌落，在營養瓊脂斜麵上純化培養。檸檬酸杆菌在SS瓊脂平板上的可疑菌落為圓形，粉紅色、黑色、無色菌落，或粉紅色、黑色中心菌落；在BS瓊脂平板上的可疑菌落為棕綠色或棕黑色菌落。
SS瓊脂培養基檢驗原理：
䏡腖、牛肉浸粉提供碳源、氮源、維生素和礦物質；乳糖為可發酵的糖類；三號膽鹽、枸櫞酸鈉和煌綠抑製革蘭氏陽性菌及大多數的大腸菌群和變形杆菌；硫代硫酸鈉和枸櫞酸鐵用於檢測硫化氫的產生，使菌落中心呈黑色；中性紅為pH指示劑，發酵糖產酸的菌落呈紅色，不發酵糖的菌落為無色；瓊脂是培養基的凝固劑。
SS瓊脂培養基用法：
稱取本品63.53g，溶解於1000mL蒸餾水中，加熱煮至沸，不必高壓蒸汽滅菌，冷至45℃-50℃倒成平板。培養結果如圖2所示：
圖2 弗氏檸檬酸杆菌ATCC 43864在SS瓊脂平板上的培養結果
亞硫酸鉍瓊脂（BS）檢驗原理：
蛋白腖、牛肉粉在培養基中作為基礎營養物質，為細菌生長提供所需的氮源、碳源、維生素及一些礦物質等元素；葡萄糖可作為細菌生長代謝所需的能量物質；磷酸鹽對培養環境pH值起到緩衝作用。煌綠和亞硫酸鈉能抑製大腸杆菌、變形杆菌和革蘭氏陽性菌的生長。傷寒沙門氏菌及其他沙門氏菌能利用葡萄糖，將亞硫酸鹽還原成硫化物並與硫酸亞鐵反應使得菌落呈黑色，此外還可把鉍離子還原成金屬鉍，使菌落呈現金屬光澤，從而使沙門氏菌得到分離。
亞硫酸鉍瓊脂（BS）用法：
稱取本品50.3g，加入1000 mL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，冷至45℃-50℃，搖勻，傾入無菌平皿備用。無需高壓滅菌。保存於黑暗處，48小時內使用。培養結果如圖3所示：
圖3 弗氏檸檬酸杆菌ATCC 43864在BS瓊脂平板上的培養結果
3.3 分離鑒定
3.3.1 方法選擇
對挑選的菌體進行革蘭氏染色，氧化酶試驗初步生化鑒定。革蘭氏染色陰性，氧化酶試驗陰性按3.3.2進行初步生化試驗。革蘭氏染色結果如圖4A，氧化酶試驗結果如圖4B：
圖4 弗氏檸檬酸杆菌ATCC 43864革蘭氏染色結果，弗氏檸檬酸杆菌ATCC 43864氧化酶實驗結果
3.3.2 初步生化鑒定
使用營養瓊脂平板或斜麵上純化分離的新鮮培養物（培養時間不超過24h）進行動力試驗、ONPG試驗、檸檬酸鹽試驗、DNA酶試驗（或明膠液化試驗）和V-P試驗。動力試驗、ONPG試驗和檸檬酸鹽試驗陽性，DNA酶試驗（或明膠液化試驗）和V-P試驗陰性的菌落為檸檬酸杆菌屬細菌。再次用營養瓊脂純化培養18h～24h後，進行後續生化試驗。初步生化鑒定結果如圖5所示：
圖5 弗氏檸檬酸杆菌ATCC 43864初步生化鑒定結果
3.3.3 生化鑒定
使用營養瓊脂上的新鮮培養物（培養時間不超過24 h）按表1各項生化試驗進行檸檬酸杆菌各種的鑒定。確證鑒定結果如圖6所示：
表1 檸檬酸杆菌屬生化鑒定表
|
確證實驗 |
弗氏檸檬 酸杆菌 （C.freundii） |
科氏檸檬 酸杆菌 （C.diversus） |
無丙二酸鹽 檸檬酸杆菌 （C.amalonaticus） |
|
水楊酸發酵產酸 |
﹣ |
V(﹣) |
V |
|
D-戊糖醇發酵產酸 |
﹣ |
＋ |
﹣ |
|
產硫化氫 |
V(＋) |
﹣ |
﹣ |
|
鳥氨酸脫酸酶 |
V(﹣) |
＋ |
＋ |
|
靛基質 |
﹣ |
＋ |
＋ |
|
丙二酸鹽利用 |
V(﹣) |
＋ |
﹣ |
|
注：＋：≥90%陽性；(＋)：75%~89%陽性；d：不同菌株不定；(﹣)：75%~89%陰性；﹣：≥90%陰性。 |
|||
圖6 弗氏檸檬酸杆菌確證生化鑒定結果
四、結果判定與結果報告
4.1 結果判定
4.1.1 檸檬酸杆菌屬
革蘭氏染色陰性，氧化酶實驗陰性，生化反應符合3.3.2要求的菌落，判定為檸檬酸杆菌屬細菌。
4.1.2 檸檬酸杆菌
革蘭氏染色陰性，氧化酶實驗陰性，生化反應結果與3.3.2和3.3.3中表1的生化反應結果相符，或根據生化鑒定試劑盒、生化鑒定係統鑒定到檸檬酸杆菌屬的結果，可判定為特定的檸檬酸杆菌。
4.2 結果報告
生化鑒定結果符合檸檬酸杆菌生化特性，按增菌培養的陽性瓶數，應用MPN表，查出每100 g樣品中的MPN值。檢測結果報告為每100 g樣品中檸檬酸杆菌（屬或種）的MPN值。
表2 最可能數（MPN）表（95%置信區間）
使用三管法，接種量分別為10.0 g，1.0 g和0.1 g。
|
陽性管數 |
MPN /100g |
可信限 |
陽性管數 |
MPN /100g |
可信限 |
||||||
|
10 |
1 |
0.1 |
低 |
高 |
10 |
1 |
0.1 |
低 |
高 |
||
|
0 |
0 |
0 |
＜3.0 |
- |
9.5 |
2 |
2 |
0 |
21 |
4.5 |
42 |
|
0 |
0 |
1 |
3.0 |
0.15 |
9.6 |
2 |
2 |
1 |
28 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
0 |
3.0 |
0.15 |
11 |
2 |
2 |
2 |
35 |
8.7 |
94 |
|
0 |
1 |
1 |
6.1 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
0 |
29 |
8.7 |
94 |
|
0 |
2 |
0 |
6.2 |
1.2 |
18 |
2 |
3 |
1 |
36 |
8.7 |
94 |
|
0 |
3 |
0 |
9.4 |
3.6 |
38 |
3 |
0 |
0 |
23 |
4.6 |
94 |
|
1 |
0 |
0 |
3.6 |
0.17 |
18 |
3 |
0 |
1 |
38 |
8.7 |
110 |
|
1 |
0 |
1 |
7.2 |
1.3 |
18 |
3 |
0 |
2 |
64 |
17 |
180 |
|
1 |
0 |
2 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
0 |
43 |
9 |
180 |
|
1 |
1 |
0 |
7.4 |
1.3 |
20 |
3 |
1 |
1 |
75 |
17 |
200 |
|
1 |
1 |
1 |
11 |
3.6 |
38 |
3 |
1 |
2 |
120 |
37 |
420 |
|
1 |
2 |
0 |
11 |
3.6 |
42 |
3 |
1 |
3 |
160 |
40 |
420 |
|
1 |
2 |
1 |
15 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
0 |
93 |
18 |
420 |
|
1 |
3 |
0 |
16 |
4.5 |
42 |
3 |
2 |
1 |
150 |
37 |
420 |
|
2 |
0 |
0 |
9.2 |
4.4 |
38 |
3 |
2 |
2 |
210 |
40 |
430 |
|
2 |
0 |
1 |
14 |
3.6 |
42 |
3 |
2 |
3 |
290 |
90 |
1000 |
|
2 |
0 |
2 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
0 |
240 |
42 |
1000 |
|
2 |
1 |
0 |
15 |
3.7 |
42 |
3 |
3 |
1 |
460 |
90 |
2000 |
|
2 |
1 |
1 |
20 |
4.5 |
42 |
3 |
3 |
2 |
1100 |
180 |
4100 |
|
2 |
1 |
2 |
27 |
8.7 |
91 |
3 |
3 |
3 |
＞1100 |
420 |
- |
|
注：如果接種量擴大10倍，分別為100.0g，10.0g和1g時，表中的數字相應縮小10倍。如果接種量縮小10倍，分別為1.0g，0.1g和0.01g時，表中的數字相應擴大10倍，其餘類推。 |
|||||||||||
相關標準：
SN/T 2552.6-2010 乳與乳製品衛生微生物學檢驗方法 第6部分：檸檬酸杆菌檢驗 點擊下載
相關產品：
注:本文屬betway必威西汉姆联生物原創,未經允許不得轉載。
上一篇：蠟樣芽孢杆菌檢驗方法及結果判斷
下一篇：陰溝腸杆菌的檢驗方法及結果判斷
