銅綠假單胞菌檢驗方法-化妝品安全技術規範(2022年版)

1.範圍

  本規範規定了化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗方法。

  本規範適用於化妝品中銅綠假單胞菌的檢驗。

2.定義

  2.1銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa

  屬於假單胞菌屬，為革蘭氏陰性杆菌，氧化酶陽性，大部分能產生綠膿菌素。

3.儀器

  3.1 恒溫培養箱:36℃±1℃、42℃±1℃。

  3.2 三角瓶:250mL。

  3.3 試管:18 mm×150mm。

  3.4 滅菌平皿:直徑90mm。

  3.5 滅菌刻度吸管:10mL、 1mL。

  3.6 顯微鏡。

  3.7 載玻片。

  3.8 接種針、接種環。

  3.9 電磁爐。

  3.10 高壓滅菌器。

  3.11 恒溫水浴箱。

4.培養基和試劑

  4.1 SCDLP液體培養基

  見總則中3.2。

  4.2 十六烷基三甲基溴化銨培養基

成分:	牛肉膏	3g
	蛋白腖	10g
	氯化鈉	5g
	十六烷基三甲基溴化銨	0.3g
	瓊脂	20g
	蒸餾水	1000mL

  製法:除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調pH為7.4~7.6，加入瓊脂，115℃高壓滅菌20min後，製成平板備用。

  4.3 乙酰胺培養基

成分:	乙酰胺	10.0g
	氯化鈉	5.0g
	無水磷酸氫二鉀	1.39g
	無水磷酸二氫鉀	0.73g
	硫酸鎂（MgSO4.7H2O)	0.5g
	酚紅	0.012g
	瓊脂	20g
	蒸餾水	1000mL

  製法:除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH為7.2，加入瓊脂、酚紅，121℃高壓滅菌20min後，製成平板備用。

  4.4 綠膿菌素測定用培養基

成分:	蛋白腖	20g
	氯化鎂	1.4g
	硫酸鉀	10g
	瓊脂	18g
	甘油(化學純)	10g
	蒸餾水	1000mL

  製法:將蛋白腖、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加熱使其溶解，調pH至7.4，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝於試管內，115℃高壓滅菌20min後，製成斜麵備用。

  4.5 明膠培養基

成分:	牛肉膏	3g
	蛋白腖	5g
	明膠	120g
	蒸餾水	1000mL

  製法:取各成分加到蒸餾水中浸泡20min，隨時攪拌加熱使之溶解，調pH至7.4，分裝於試管內，經115℃高壓滅菌20min後，直立製成高層備用。

  4.6 硝酸鹽蛋白腖水培養基

成分:	蛋白腖	10g
	酵母浸膏	3g
	硝酸鉀	2g
	亞硝酸鈉	0.5g
	蒸餾水	1000mL

  製法:將蛋白腖和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調pH為7.2，煮沸過濾後補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，115℃高壓滅菌20min後備用。

  4.7 普通瓊脂斜麵培養基

成分:	蛋白腖	10g
	牛肉膏	3g
	氯化鈉	5g
	瓊脂	15g
	蒸餾水	1000mL

  製法:除瓊脂外，將其餘成分溶解於蒸餾水中，調pH為7.2~7.4，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌20min後，製成斜麵備用。

5操作步驟

  5.1 增菌培養:取1:10檢液10mL加到90mL SCDLP液體培養基中,置36℃±1℃培養18h~24h。如有銅綠假單胞菌生長，培養液表麵多有一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。

  5.2 分離培養:將增菌後的培養物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置36℃±1℃培養18h~24h。凡銅綠假單胞菌在此培養基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表麵濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養基常擴散有水溶性色素。

  在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養基進行分離,將增菌後的培養物劃線接種於平板上，置36℃±1℃培養24h±2h，銅綠假單胞菌在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養基呈紅色，其他菌不生長。

  5.3 染色鏡檢:挑取可疑的菌落，塗片，革蘭氏染色（見耐熱大腸菌群檢驗方法4.5.2)，鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。

  5.4 氧化酶試驗:取一小塊潔淨的白色濾紙片置於滅菌平皿內，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落塗在濾紙片上，然後在其上滴加一滴新配製的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在15s~30s之內，出現粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性;若培養物不變色，為氧化酶試驗陰性。

  5.5 綠膿菌素試驗:取可疑菌落2個~3個，分別接種在綠膿菌素測定用培養基上，置36℃±1℃培養24h±2h，加入三氯甲烷3mL~5mL，充分振蕩使培養物中的綠膿菌素溶解於三氯甲烷液內，待三氯甲烷提取液呈藍色時，用吸管將三氯甲烷移到另一試管中並加入1mol/L的鹽酸1mL左右，振蕩後，靜置片刻。如上層鹽酸液內出現粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。

  5.6 硝酸鹽還原產氣試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，接種在硝酸鹽腖水培養基中，置36℃±1℃培養 24h±2h，觀察結果。凡在硝酸鹽腖水培養基內的小倒管中有氣體者，即為陽性，表明該菌能還原硝酸鹽，並將亞硝酸鹽分解產生氮氣。

  5.7 明膠液化試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置36℃±1℃培養24h±2h，取出放置於4℃±2℃冰箱10min~30min，如仍呈溶液狀或表麵液化時即為明膠液化試驗陽性;如凝固不溶者為陰性。

  5.8 42℃生長試驗:挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養物，接種在普通瓊脂斜麵培養基上，置於42℃±1℃培養箱中，培養24h~48h，銅綠假單胞菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。

6.檢驗結果報告

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