一、支原體簡介
支原體結構簡單，缺乏細胞壁，僅有質膜，胞體內有核蛋白體以及一個由環形雙鏈DNA分子組成的原核。大小僅有0.1~0.3μm，最小直徑約為100毫微米，可通過濾菌器，會幹擾細胞培養等工作的進行。由於能形成絲狀與分枝形狀，故稱為支原體。
不同支原體利用的能源物質不同，如發酵葡萄糖的肺炎支原體、人型支原體等，水解精氨酸的口腔支原體等，還有利用尿素作為能源的解脲支原體。可利用發酵葡萄糖、水解精氨酸、水解尿素等生化反應鑒別支原體。
支原體營養要求一般比細菌高，除必須的基礎營養物質外，還需添加10%~20%的動物血清以提供支原體所需的膽固醇。由於大多數的支原體兼性厭氧，有些菌株在活化分離時保持5%~10%二氧化碳環境生長狀態更好。解脲支原體在厭氧條件下生長更好。
支原體無細胞壁，對滲透壓敏感，對抑製細胞壁合成的抗生素不敏感，因此可添加青黴素抑製細菌的生長。由於滲透壓突變會導致支原體破裂死亡，因此培養支原體時，維持適宜的滲透壓顯得格外重要。此外，在支原體培養中，pH也是重要因素。
二、肺炎支原體檢驗依據及培養基原理
支原體檢查法在2020年版《中華人民共和國藥典》中體現，要求使用支原體肉湯培養基培養監測肺炎支原體。具體操作要求為：將肺炎支原體稀釋至10-7~10-9，接種在支原體肉湯培養基中，每個稀釋度接種3支試管，置於36℃培養7-14天，觀察培養基變色結果。肺炎支原體可以發酵培養基中的葡萄糖，使培養基的pH值降低，遇指示劑酚紅使培養基變黃。
豬胃消化粉、牛肉浸粉、酵母浸粉提供碳氮源、維生素和生長因子；葡萄糖為可發酵的糖類；氯化鈉維持滲透壓；酚紅為指示劑。
三、培養基配方（g/L）
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豬胃消化粉 |
10.0 |
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牛肉浸粉 |
5.0 |
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酵母浸粉 |
5.0 |
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氯化鈉 |
2.5 |
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葡萄糖 |
5.0 |
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酚紅 |
0.02 |
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pH 7.6±0.2（25℃） |
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四、試驗方法
1、稱取本品27.52g，加熱溶解於800mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鍾，冷至室溫，無菌操作加入滅活小牛血清或馬血清200mL和青黴素80萬單位，混勻，分裝無菌試管，備用。
2、製備質控菌株，接種到培養基中，並梯度稀釋至-9，並做空白對照。
3、放置於36℃±1℃恒溫培養箱中，需氧培養7-14天。
五、試驗注意事項
1、若使用非一次性試管等容器進行試驗，容器使用前應使用蒸餾水衝洗幹淨，確保無洗滌液等殘留物，以免增加試驗的不確定性或汙染。
2、滅菌結束後，試管口會有水珠，在進行梯度稀釋時，水珠很容易與空氣中的細菌接觸以致汙染，因此，試管口應灼燒至幹燥，膠塞也需過火，振蕩操作後，若培養基接觸到膠塞，還需再次進行灼燒管口。
3、調節pH時，使用的酸堿試劑均應是滅菌後的。
4、支原體培養前應使用封口膜封口，可提供微需氧環境以及降低汙染的風險。
六、質控結果
接種以下質控菌株，放置於36℃±1℃恒溫培養箱中，需氧培養7~14天。培養至12天的試驗結果如圖1所示。
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質控菌株 |
菌株編號 |
接種量（CFU） |
生長情況 |
其它特征 |
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肺炎支原體 |
ATCC 15531 |
/ |
+++ |
10（-9）稀釋度變黃色 |
圖1 支原體肉湯培養肺炎支原體12天的靈敏度
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