PPLO肉湯培養基的原理和使用方法

一、用途及試驗原理

  用於支原體分離和培養的基礎培養基。

  䏡腖、蛋白腖、牛肉浸粉、牛心浸粉提供氮源、維生素、氨基酸和生長因子；氯化鈉可維持均衡的滲透壓。

二、培養基配方（g/L）

三、試驗方法

  1、稱取本品21 g，加熱溶解於700 mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鍾，冷至50℃-60℃時加入300 mL添加劑（包括200 mL馬血清和100 mL除菌的新鮮酵母浸液），混勻，備用。

  新鮮酵母浸出液製備方法：取500 g鮮酵母或250 g酵母幹粉，加入至1.5 L雙蒸水中，攪拌均勻，充分溶解後煮沸15 min，快速冷卻，4000 r/min離心15 min，取上清液，再煮沸15 min，冷卻後用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌或116℃高壓滅菌20 min。

  為簡化操作，可使用酵母浸粉配製的溶液替代新鮮酵母浸液，酵母浸粉溶液的配製方法為，將5 g酵母浸粉添加至100 mL蒸餾水中混勻，可替代100 mL新鮮酵母浸出液。

  2、製備質控菌株，接種至培養基中，做10倍係列稀釋，稀釋至10-9，並做空白對照。

  3、放置於36℃±1℃恒溫培養箱中，微需氧培養7-14天。

四、試驗注意事項

  1、培養肺炎支原體時，培養基需額外添加葡萄糖（為可發酵的糖）；培養口腔支原體時，培養基需額外添加精氨酸（為可水解的氨基酸）；進行靈敏度試驗時需額外添加酚紅（指示劑）。

  2、由於馬血清為深黃色，培養基添加馬血清後，會幹擾結果判定，為解決這一問題，可將培養基的pH調至偏上限，如pH值為7.9。

  3、若使用非一次性試管等容器進行試驗，容器使用前應使用蒸餾水衝洗幹淨，確保無洗滌液等殘留物，以免增加試驗的不確定性或汙染。

  4、滅菌結束後，試管口會有水珠，在進行梯度稀釋時，水珠很容易與空氣中的細菌接觸以致汙染，因此，試管口應灼燒至幹燥，膠塞也需過火，振蕩操作後，若培養基接觸到膠塞，還需再次進行灼燒操作。

  5、調節pH時，使用的酸堿試劑均應是滅菌後的。

  6、支原體培養前應使用封口膜封口，可提供微需氧環境以及降低汙染的風險。

五、質控結果

  接種以下質控菌株，放置於36℃±1℃恒溫培養箱中，需氧培養7~14天。肺炎支原體、口腔支原體分別培養至11、5天的試驗結果分別如圖1、2所示。

圖1 PPLO肉湯培養基培養肺炎支原體11天的靈敏度

圖2 PPLO肉湯培養基培養口腔支原體5天的靈敏度

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