放線菌主要通過無性孢子進行繁殖。無性孢子主要有分生孢子和孢子囊孢子。也可借菌絲斷片繁殖。
（1）分生孢子
放線菌長到一定階段，一部分氣生菌絲形成孢子絲，孢子絲成熟便分化形成許多孢子，稱分生孢子。孢子的產生通過二種橫隔分裂方式。
① 細胞質膜內陷，由外逐漸向內收縮並合成橫膈膜，將孢子絲分隔成許多孢子。此為主要方式。
② 細胞壁與質膜同時內陷，逐漸向內縊縮，形成橫隔壁，然後斷裂形成一串孢子。諾卡菌屬常以這種方式繁殖。
（2）孢子囊孢子
有的放線菌由菌絲盤卷形成孢子囊。其間產生橫隔，形成孢子。孢子囊成熟後，釋放出孢子。孢子囊可在氣生菌絲、也可在基內菌絲上形成。
（3） 菌絲斷片
放線菌也可藉菌絲斷裂的片段，形成新菌絲體。這種現象常見於液體培養。工業發酵生產抗生素時，放線菌就以此方式大量繁殖。如果靜止培養，培養物表麵往往形成菌膜，膜上也可生出孢子。
（4） 其他方式
小單孢菌科（Micromonosporaceae）中多數種的孢子著生在直而短的營養菌絲的分叉頂端上，一個枝叉頂端形成一個球形、橢圓形或長圓形的孢子，這些孢子也稱分生孢子。它們聚在一起，很像一串葡萄。某些放線菌偶爾也會產生厚壁孢子。
放線菌的孢子具有較強的耐幹燥能力，但不耐高溫，60～65°C處理10～15min即會失去生活能力。
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