“三區劃線法”是實驗室最常用的平板劃線接種方法，通過在平板上劃線，將細菌在瓊脂平板表麵充分地分散開，使單個細菌能固定在一點上繁殖，形成單個菌落，以達到分離純化地目的，常常分三個區域進行劃線，故稱為“三區劃線法”。
“三區劃線法”的操作：第一區起始位置可反複劃線，然後之字形劃線，劃線區域不超過平板1/3；第二區，平板旋轉60度，之字形劃線，最初的幾條線與第一區的右側末端交叉且之字劃線，之後連續劃線不再與一區接觸；第三區，平板再旋轉60度，進行三區劃線，規則與第二區劃線相同。各區首尾相接，菌量逐步減少，達到形成單個菌落的目的。
為什麽劃不出單菌落？常見原因如下：
1.沒有充分利於好劃線區域；
2.各區域線過於密集，線與線之間重疊；
3.與前一區交叉過多；
4.劃線時接種環接觸點變動，未始終保持接種環的一點接觸瓊脂表麵；
5.未掌握好劃線力度與角度，劃破瓊脂；
6.待接種的細菌菌量過多時，可在第一區劃線完成後進行灼燒，再進行第二、三區的劃線。
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