1 主題內容與適用範圍
本標準規定了單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗方法。
本標準適用於食品和食物中毒樣品中單核細胞增生李斯特氏菌的檢驗。
2 引用標準
GB 4789.28 食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑
3 設備和材料
3.1 溫箱30℃和25C。
3.2 天平。
3.3 500mL三角瓶。
3.4 接種環。
3.5 接種針。
3.6 載玻片。
3.7 蓋玻片。
3.8 顯微鏡或相差顯微鏡。
3.9 平皿。
3.10 試管。
3.11 均質器。
3.12 無菌注射器。
3.13 吸管：1mL，10mL。
3.14 單核細胞增生李斯特氏菌標準株。
3.15 馬紅球菌。
4 培養基和試劑
4.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆肉湯(TSB－YE)：見附錄A1。
4.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪大豆瓊脂(TSA－YE)：見附錄A2。
4.3 EB增菌液：見附錄A3。
4.4 LB增菌液(LB1，LB2)：見附錄A4。
4.5 三糖鐵(TSI)瓊脂：GB 4789.28中4.26，4.27。
4.6 SIM動力培養基：見附錄A5。
4.7 血瓊脂：GB 4789.28中4.6。
4.8 改良的Mc Bride(MMA)瓊脂：見附錄A5。
4.9 硝酸鹽培養基：GB 4789.28中3.17。
4.10 緩衝葡萄糖蛋白腖水(MR和VP試驗用)：GB 4789.28中3.4。
4.11 糖發酵培養基：GB 4789.28中3.2。
4.12 過氧化氫酶試驗：GB 4789.28中4.38。
4.13 鹽酸吖啶黃(AcriflavineHCl)(Sigma)。
4.14 萘啶酮酸鈉鹽(Naladixicacid)(Sigma)。
5 檢驗程序
單核細胞增生李斯特氏菌檢驗程序如下：
（略）
6 操作步驟
6.1 樣品的收集及處理
無菌采取樣品25g(mL)放滅菌均質器中加225mLEB和LB增菌液中，充分攪拌成均質。如不能及時檢驗，可暫存4℃冰箱。
6.2 增菌培養
EB增菌液放30±1℃培養48h～7d，LB1增菌液225mL放30±1℃，培養24h，取出0.1mL，加入10mL LB2增菌液中二次增菌。
6.3 分離培養
將EB增菌液和LB2二次增菌液分離於選擇培養基MMA瓊脂平板上，培養30±1℃48h，挑選可疑菌落，用白熾燈45°角斜光照射平板，李斯特氏菌的菌落為灰藍或藍色，小的圓形的菌落。
6.4 選5個以上的上述可疑菌落接種三糖鐵(TSI)瓊脂和SIM動力培養基，培養於25±1℃，觀察是否有動力，且成傘狀或月芽狀生長。一般觀察2～7d，陽性者可做下一步鑒定。
6.5 純培養
將上述有動力、形成傘狀者並在三糖鐵瓊脂培基上層、下層的產酸而不產硫化氫的可疑培養物接種於胰酪腖大豆瓊脂培養基(TSA－YE)上，做純培養供做以下鑒定。
6.6 染色鏡檢
將上述可疑純培養物做革蘭氏染色並做濕片檢查；李斯特氏菌為革蘭氏陽性小杆菌，大小為0.4～0.5μm×0.5～2.0μm；用生理鹽水製成菌懸液，在油鏡或相差顯微鏡下觀察，該菌出現輕微旋轉或翻滾樣的運動。
6.7 生化特性
將上述可疑菌做進一步的生化試驗，單核細胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及有關菌的區別見表1。
表1單核細胞增生李斯特氏菌生化性狀與有關菌的區別
（表略）
6.8 對小鼠的致病力試驗
將符合上述特性的純培養物接種於TSB－YE中，在30℃培養24h，離心，濃縮，使濃縮液每毫升1010/mL個細菌，取0.5mL濃縮菌液注射小白鼠腹腔，3～5隻，觀察小鼠死亡情況。致病株於2～5d內死亡。試驗時可用已知菌作對照。單核細胞增生李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌對小鼠有致病性。
6.9 協同溶血試驗(cAMP)
在血平板上平行接種金黃色葡萄球菌和馬紅球菌(R.equi)，在它們中間垂直接種可疑李斯特氏菌，但不要觸及它們，在30℃培養24～48h，檢查平板中垂直接種點對溶血環的影響。靠近金黃色葡萄球菌接種點的單核細胞增生李斯特菌的溶血增強，西爾李斯特氏菌的溶血也增強，而綿羊李斯特氏菌在馬紅球菌附近的溶血增強，有助於鑒別。
附錄A
培養基
(補充件)
A1 含0.6%酵母漫膏的胰酪腖大豆肉湯(TSB－YE)
A1.1 成分
胰腖 17g
多價腖 3g
酵母膏 6g
氯化鈉 5g
磷酸氫二鉀 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸餾水 1000mL
A1.2 製法
將上述各成分加熱攪拌溶解，調至pH7.2～7.4，分裝，121℃滅菌15min，備用。
A2 含0.6%酵母膏胰酪腖大豆瓊脂(TSA－YE)
A2.1 成分
胰腖 17g
多價腖 3g
酵母膏 6g
氯化鈉 5g
磷酸氫二鉀 2.5g
葡萄糖 2.5g
瓊脂 15g
蒸餾水 1000mL
A2.2 製法
將上述各成分加熱攪拌溶解，調pH至7.2～7.4，分裝，121℃高壓滅菌,備用。
A3 EB增菌液
A3.1 成分
胰腖 17g
多價腖 3g
酵母膏 6g
氯化鈉 5g
磷酸氫二鉀 2.5g
葡萄糖 2.5g
蒸餾水 1000mL
鹽酸吖啶黃 15mg/L
萘啶酮酸 40mg/L
A3.2 製法
除吖啶黃和萘啶酮酸外，其餘成分加熱混合調pH至7.2～7.4，121℃15min高壓滅菌。使用前加吖啶黃溶液15mg/L和萘啶酮酸溶液40mg/L，此兩種成分要無菌配製或過濾除菌。
A4 李氏增菌肉湯(LB1，LB2)
A4.1 成分
胰腖 5g
多價腖 5g
酵母膏 5g
氯化鈉 ? ?g
磷酸二氫鉀 1.35g
磷酸氫二鈉 12g
七葉苷 1g
蒸餾水 1000mL
A4.2 製法
將上述成分加熱溶解，調pH至7.2～7.4，分裝，121℃15min高壓滅菌。
A4.2.1 李氏I液(LB1)225mL中加入：
1%萘啶酮酸(用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配製) 0.45mL
1%吖啶黃(用滅菌蒸餾水配製) 0.27mL
A4.2.2 李氏Ⅱ液(LB2)200mL中加入：
1%萘啶酮酸 0.40mL
1%吖啶黃 0.50mL
無菌分裝於10mL大試管中。
A5 改良的Mc Bride瓊脂(MMA)
A5.1 成分
胰腖 5g
多價腖 5g
牛肉膏 3g
葡萄糖 1g
氯化鈉 5g
磷酸氫二鈉 1g
苯乙醇 2.5mL
無水甘氨酸 10g
氯化鋰 0.5g
瓊脂 15g
蒸餾水 1000mL
A5.2 製法
將上述成分加熱攪拌混勻，調pH至7.2～7.4，分裝，121℃ 15min高壓滅菌，備用。
A6 SIM動力培養基
A6.1 成分
胰腖 20g
多價腖 6g
硫酸鐵銨 0.2g
硫代硫酸鈉 0.2g
瓊脂 3.5g
蒸餾水 1000mL
A6.2 製法
將上述各成分加熱混勻，調pH7.2，分裝小試管，高壓滅菌121℃ 15min。
附加說明：
本標準由衛生部衛生監督司提出。
本標準由衛生部食品衛生監督檢驗所負責起草。
本標準主要起草人白竟玉、付萍、李誌剛。
本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。
本標準參照采用美國食品藥品管理局(FDA)細菌學分析手冊(第六版)增補材料第二十九章李斯特氏菌部分(1987)。
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