1. 分析目標化合物
土黴素,金黴素,四環素
2. 儀器設備
帶熒光檢測器的高效液相色譜儀。
3.試劑
除下列試劑外,使用附錄2所列試劑。
咪唑:特級
咪唑緩衝溶液:將68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸鎂溶解在800mL水中,用乙酸調節pH7.2後,加水至1,000mL。
含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液:第1液:將21.0g檸檬酸溶解在水中至1,000mL。第2液:將71.6g磷酸氫二鈉溶解在水中至1,000mL。在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解。
苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg):在內徑8~9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色譜用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分離特性的物質。
4.標準品
鹽酸土黴素:本品1.000mg 含有土黴素0.850mg以上效價,分解點為190℃~194℃。
鹽酸金黴素:本品1.000mg含有鹽酸金黴素0.900mg以上效價,分解點為210℃以上。
鹽酸四環素:本品1.000mg 含有鹽酸四環素0.900mg以上效力,分解點為214℃以上。
5.試驗溶液的製備
a 提取方法
①肌肉、肝髒和腎髒
肌肉:盡可能除去脂肪層,攪碎混合均勻後,稱取其5.00g。
肝髒和腎髒:攪碎混合均勻後,稱取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,攪拌1分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,水層移入100mL分液漏鬥中。離心分離管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鍾後,按上述同樣條件離心分離,合並水層於上述分液漏鬥中。加入20mL正己烷, 用振蕩器激烈振蕩5分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層。
② 脂肪
脂肪:盡可能除去肌肉層,攪碎混合均勻後,稱取其20.0g。
加入200mL正己烷,攪拌1分鍾後,加入40mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,再攪拌1分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層。正己烷層中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鍾後,按上述同樣條件離心分離,分取水層,合並於先分取的水層中。
③ 奶
稱取5.00g樣品,加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液和20mL正己烷,用振蕩器激烈振蕩5分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層。
④ 蛋
除去蛋殼,充分均勻後,稱取其5.00g。加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,均勻後,加入100mL正己烷,攪拌1分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,水層移入100mL分液漏鬥中。離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鍾後,按上述同樣條件離心分離,合並水層於分液漏鬥中。加入20mL正己烷, 用振蕩器振蕩5分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層。
⑤ 魚貝類
有殼貝類:除去殼,攪碎混合均勻後,稱取其5.00g。
其它的魚貝類:攪碎混合均勻後,稱取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,攪拌1分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,水層移入100mL分液漏鬥中。離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鍾後,按上述同樣條件離心分離,合並水層於分液漏鬥中。加入20mL正己烷, 用振蕩器激烈振蕩5分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層。
b 淨化方法
在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱(265mg)中,順次注入10mL甲醇、10mL水和5mL飽和EDTA溶液,棄去流出液。柱中注入a提取方法所得的溶液後,注入10mL水,棄去流出液。注入10mL甲醇,收集流出液於磨口減壓濃縮器中,40℃以下除去甲醇。殘留物中加入1.0mL 1.36%磷酸二氫鉀溶液溶解,此為試驗溶液。
6.操作方法
a 定性試驗
按下列操作條件進行試驗,試驗結果必須與標準品的一致。
操作條件
柱填充劑:十八烷基甲矽烷基化矽膠(粒度5μm)。
柱:內徑4.0~6.0mm,長150mm不鏽鋼管。
柱溫: 40℃
檢測器:激發波長380nm,發射波長520nm。
流動相:土黴素和四環素試驗時,用咪唑緩衝溶液:甲醇(17:3)的混合溶液。調整流速使土黴素約5分鍾流出。
金黴素試驗時,用咪唑緩衝溶液:甲醇(3:1)的混合溶液。調整流速使金黴素約7分鍾流出。
b 定量試驗
根據與a 定性試驗相同操作條件所得的試驗結果,峰高法或峰麵積法定量。
7.定量限
a 肌肉,肝髒,腎髒,奶,蛋和魚貝類
土黴素:0.02 mg/kg
金黴素:0.03 mg/kg
四環素:0.02 mg/kg
b 脂肪
土黴素:0.005 mg/kg
8.注意事項
(1) 試驗溶液的製備
① 離心分離溫度保持在室溫。
② 抽濾後濾液混濁時,濾液再次進行離心分離。
③ 在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色譜中,注入試驗溶液後,30mL水分數次加入效果較好地洗浄柱中殘留的乙二胺四乙酸。
(2) 標準溶液的配製
①稱取相當於10.0mg土黴素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為土黴素的標準原液(土黴素1,000mg(效價)/L,1,000mg/L)。本標準原液保存在-20℃,1年內穩定。
②稱取相當於10.0mg金黴素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為金黴素的標準原液(金黴素1,076mg(效價)/L,1,000mg/L)。本標準原液保存在-20℃,1年內穩定。
③稱取相當於10.0mg四環素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為四環素的標準原液(四環素1,082mg(效力)/L,1,000mg/L)。本標準原液保存在-20℃,1年內穩定。
④用1.36%磷酸二氫鉀溶液將土黴素,金黴素和四環素各標準原液遞減稀釋,作為製作標準曲線用的標準溶液。
(3) 其它
①同時進行很多樣品試驗的篩選試驗法提高判斷効率時,用「○土黴素,金黴素和四環素的篩選法(參照117 頁)」判斷為陽性的,不妨用本檢測方法實施試驗。
②使用本檢測方法檢出土黴素,金黴素和四環素時,最好用帶質量檢測器的高效液相色譜儀確證。
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