KCN生化反應注意事項

一、簡介

  KCN試驗是腸杆菌科各屬間的重要鑒別試驗方法之一，可將沙門氏菌屬和誌賀氏菌屬與其他腸道菌屬相區別。

  其原理是KCN可以抑製某些細菌的呼吸酶係統，細胞色素氧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶均以鐵卟啉作為輔基，KCN能和鐵卟淋結合，使這些酶失去活性，使細菌生長受到抑製。

二、試驗說明

  在做KCN試驗時，需要同時接種KCN反應管和KCN對照管，按照一定條件培養足夠時間後，KCN反應管中無菌生長（澄清），對照管中有菌生長（渾濁），或者反應管不如對照管渾濁，則判定為KCN試驗陰性。

三、操作要點

  做微生物的生化鑒定時，為了達到較好的試驗效果，通常會使接種的菌液盡量濃，對於一些通過顏色變化判斷結果的生化試驗，這是非常有效的方法（見“生化鑒定條使用注意事項及討論”），但因為KCN試驗是通過澄清度來判斷結果，如果一開始加入的菌量很多，就可能會使反應管尚未培養即有肉眼可見的渾濁，這樣就不好判斷究竟是陽性還是陰性。特別是使用生化鑒定條類產品時，產品說明書建議每孔加入100μL菌懸液（菌懸液製備：取一內盛2mL無菌水或無菌生理鹽水試管，用接種針從營養瓊脂平板上挑取單個菌落至無菌生理鹽水中仔細研磨製成均一細菌懸液，每孔加入100μL菌懸液。參考HBI沙門氏菌生化鑒定條(GB)）。這樣一來，如果菌懸液濃度過高，更容易出現假陽性現象（如圖1）。

圖1  菌懸液過濃產生的假陽性結果（左：對照管   右：反應管）

  為了避免這種情況的發生，在做KCN試驗時，可采用如下幾種方法接種（結果對比如圖2）：

（1）用接種環蘸取一環稀釋菌液，接種至生化管；

（2）用接種針直接沾取少量菌苔接種至生化管；

（3）如若統一使用每孔加入100μL的形式進行接種，則應使用稀菌液，菌液的加入不會造成生化管肉眼可見的渾濁。

圖2  不同接種方式培養後的試驗結果

  GB4789.4-2016中，即采用的是第2種方法（截圖如下）。

  標準中同時還特別指出，“試驗失敗的主要原因是封口不嚴，KCN逐漸分解，產生氫氰酸氣體逸出，以致藥物濃度降低，細菌生長，因而造成假陽性反應。試驗時對每一環節都要特別注意。”

  在使用我公司成品生化管做沙門氏菌時，不管封口還是開口培養，顯示的結果均是一致的（如圖3），但是為了試驗的嚴謹性，我們還是建議將KCN生化管進行封口培養。

圖3  封口培養和開口培養的試驗結果

四、注意事項

  另外，還需要提醒一下，KCN是劇毒藥，使用時應小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分裝培養基應在低溫環境中進行。即使使用成品生化管，也應盡量在通風環境中操作。

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