工具酶從20世紀40年代至60年代，從理論上已經指出了基因體外重組的可能性，但科學家們麵對龐大的雙鏈DNA分子束手無策，無法根據需要將DNA分子切割成單個的基因片段，也無法將兩個DNA片段正確地連接起來。限製性核酸內切酶的發現解決了DNA分子的切割問題，1970年，Smith和Wilcox從流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）中分離並純化了限製性核酸內切酶Hind Ⅱ；1972年，Boyer實驗室發現了Eco R I核酸內切酶，能夠識別核苷酸鏈上的GAATTC序列；從此以後，相繼發現了各種類似於Eco R I的限製性核酸內切酶，它們可以在特殊的位點切割DNA分子，因此，有人將限製性核酸內切酶形象地稱為“長眼睛的剪刀”。
幾乎與此同時的另一項重要發現是DNA連接酶。1967年，世界上有5個實驗室幾乎同時發現了DNA連接酶。這種酶能夠將DNA的裂口修複，將兩條DNA片段按預定的方向重新連接在一起。1970年，美國Khorana實驗室發現了具有更高連接活性的T4 DNA連接酶。可以毫不誇張地說DNA連接酶就是重組DNA的“縫紉針和線”。
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