1．分析目標化合物
異菌脲、N－(3，5－二氯苯)－3－異丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺
2．儀器設備
帶紫外分光光度檢測器的高效液相色譜儀。
3．試劑
使用附錄2所列試劑。
4．標準品
異菌脲：含異菌脲99％以上，熔點為135℃。
N－(3，5－二氯苯)－3－異丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺：含N－(3，5－二氯苯)－3－異丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺99％以上，熔點為200℃。
5．試驗溶液的製備
a 提取方法
① 穀類、豆類及種籽類
將樣品粉碎，通過420μm標準網篩後，稱取其20.0g。
加入100mL乙腈，放置1小時後，攪拌3分鍾，用塗布1cm厚矽藻土的濾紙抽濾，濾液移入500mL的分液漏鬥(Ⅰ)中。收集濾紙上的殘留物，加入100mL乙腈，攪拌3分鍾，用塗布1cm厚矽藻土的濾紙抽濾，合並濾液於分液漏鬥(Ⅰ)中。加入50mL乙腈飽和正己烷，用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，靜置，收集乙腈層於磨口減壓濃縮器中，40℃以下濃縮至約30mL。
將其移入預先注入100mL 10％氯化鈉溶液和100mL乙酸乙酯的500mL分液漏鬥（Ⅱ）中，用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，靜置，乙酸乙酯層移入500mL分液漏鬥(Ⅲ)。水層中加入100mL乙酸乙酯，按上述同樣方法操作，合並乙酸乙酯層於分液漏鬥(Ⅲ)中。加入50mL 10％氯化鈉溶液，用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，靜置，乙酸乙酯層移入500mL三角瓶中。加入適量無水硫酸鈉，不時振蕩、混合，放置15分鍾後，濾入磨口減壓濃縮器中。再加入50mL乙酸乙酯洗滌上述三角瓶，以此洗滌液洗滌濾紙上的殘渣，重複操作二次，合並兩洗滌液於磨口減壓濃縮器中，40℃以下除去乙酸乙酯，殘留物中加入5mL正己烷溶解。
② 水果、蔬菜和末茶
水果和蔬菜：準確稱取約1kg樣品，必要時定量加入適量的水，攪碎混合均勻後，稱取相當於20.0g樣品的量。
末茶：稱取10.0g樣品。
加入100mL丙酮，攪拌3分鍾後，用塗布1cm厚矽藻土的濾紙，抽濾於磨口減壓濃縮器中。取出濾紙上的殘留物，加入100mL丙酮，攪拌3分鍾後，按上述同樣操作，合並濾液於磨口減壓濃縮器中，40℃以下濃縮至約50mL。
加入5mol/L的氫氧化鈉溶液，調整pH6～7，移入預先注入100mL 10％氯化鈉溶液和100mL乙酸乙酯的500mL分液漏鬥(Ⅰ)中。用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，靜置，乙酸乙酯層移入500mL分液漏鬥（Ⅱ）中。水層中加入100mL乙酸乙酯，按上述同樣方法操作，合並乙酸乙酯層於分液漏鬥（Ⅱ）中。加入50mL 10％氯化鈉溶液，用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，靜置，乙酸乙酯層移入500mL三角瓶中，加入適量無水硫酸鈉，不時振搖、混合，放置15分鍾後，濾入磨口減壓濃縮器中。再加入50mL乙酸乙酯洗滌三角瓶，以此洗滌液洗滌濾紙上的殘留物，重複操作二次，合並兩洗滌液於減壓濃縮器中，40℃以下除去乙酸乙酯，殘留物中加入5mL正己烷溶解。
③末茶以外的茶
將10.0g樣品浸泡在600mL 100℃水中，室溫下放置5分鍾後，過濾，移取300mL冷卻後的濾液於500mL三角瓶(I)中。加入100mL丙酮和2mL飽和乙酸鉛溶液，輕輕振蕩15分鍾後，用塗布1cm厚矽藻土的濾紙抽濾於1000mL分液漏鬥中。再加入50mL丙酮：水（1∶1）混合液洗滌三角瓶(Ⅰ)，以此洗滌液洗滌濾紙上的殘留物，合並洗滌液於上述分液漏鬥中。加入20g氯化鈉和100mL正己烷，用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，靜置，正己烷層移入500mL分液漏鬥。水層中加入100mL正己烷，按上述同樣方法操作，合並正己烷層於上述分液漏鬥中。
加入50mL 10％氯化鈉溶液，用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，靜置，正己烷層移入500mL三角瓶中（II）中。加入適量無水硫酸鈉，不時振蕩、混合，放置15分鍾後，濾入磨口減壓濃縮器中。再加入50mL正己烷洗滌三角瓶（II），以此洗滌液洗滌濾紙上的殘留物，重複操作二次，合並兩洗滌液於減壓濃縮器中，40℃以下除去正己烷，殘留物中加入5mL正己烷溶解。
b 淨化方法
在內徑20mm，長300mm的色譜管中注入10g懸浮在正己烷中的柱色譜用合成矽酸鎂，其上麵再裝入約8g無水硫酸鈉,放出正己烷至柱上端留有少量正己烷。柱中注入a 提取方法所得的溶液後，注入100mL乙醚：正己烷（1∶1）混合溶液,棄去流出液。再注入100mL丙酮：正己烷（3∶17）混合溶液,收集流出液於磨口減壓濃縮器中，40℃以下除去正己烷，殘留物中加入乙腈溶解，準確至5mL，此為試驗溶液。
6．操作方法
a 定性試驗
按下列操作條件進行試驗，試驗結果必須與標準品的一致。
操作條件
柱填充劑：十八烷基甲矽烷基化矽膠(粒度5μm)。
柱：內徑4.5mm，長150mm不鏽鋼管。
柱溫： 25℃
檢測器：波長230nm。
流動相：乙腈：水(3：2)混合溶液。調整流速使異菌脲約9分鍾流出。
b 定量試驗
根據與a 定性試驗同樣操作條件所得試驗結果，用峰高法或峰麵積法分別對異菌脲和N－(3，5－二氯苯)－3－異丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺進行定量，由異菌脲和N－(3，5－二氯苯)－3－異丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺的和求得異菌脲的含量。
7．定量限
0.05 mg/kg
8．注意事項
對異菌脲及其代謝物N－(3，5－二氯苯)－3－異丙基－2，4－二氧代咪唑烷基－1－碳酰胺分別進行定量，它們的和為異菌脲分析值。
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