質粒載體可以克隆的DNA最大片段一般在10kb左右，但在構建一個基因文庫時往往需要克隆更大的DNA片段以減少克隆的數量。為此，人們將噬菌體發展成為一種克隆載體。
λ噬菌體屬於雙鏈線性DNA分子。野生型λ噬菌體內含有太多的限製性酶切位點，需要經過改造後才能成為可應用的載體。Charon係列λ噬菌體有插入型和替換型兩種，帶有來自大腸杆菌的β半乳糖苷酶基因lacZ。M13噬菌體是單鏈環狀DNA，改造後的M13mp8，加入了大腸杆菌的lac操縱子，常用於核酸測序。
λ噬菌體是線性雙鏈DNA分子，其長度為48502bp，兩端各有由12個堿基組成的5’端凸出的互補黏性末端，當λDNA進入宿主細胞後，互補黏性末端連接成為環狀DNA分子，這種由黏性末端結合形成的序列，稱為cos位點；λ噬菌體為溫和噬菌體，可以整合到宿主細胞染色體DNA上，以溶原狀態存在，隨染色體的複製而複製；λ噬菌體能包裝本身長度的 75%～105%，約38～54kb的DNA片段。
構建λ噬菌體載體時，需要抹去某種限製性內切酶在入DNA分子上的一些識別序列，隻在非必需區保留1～2個識別序列。若隻保留1個識別序列，則可供外源DNA插入；若保留2個識別序列，則2個識別序列之間的區域可被外源DNA片段置換也可以用合適的限製性內切酶切去部分非必需區，但是所構建的入DNA載體應不小於38kb；同時在λ噬菌體分子合適區域應插入可供篩選的標記基因。
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