基因是具有遺傳功能的DNA分子上的片段，平均長度約1000bp。早在1946年就有人提出了“一個基因一種酶”的理論，即一個基因經轉錄、翻譯後將表達一種蛋白質分子。一個完整的基因應該包括：結構基因、調節基因、操縱基因、啟動基因和終止基因，其中結構基因含有所表達蛋白質的全部信息。基因工程的目的是將性狀優良的相關基因進行重組獲得具有高度應用價值的新物種。因此，基因工程的首要任務是從現有生物群體中分離出特定的目的基因，目的基因一般都是結構基因。通過目的基因將所需的外源遺傳信息額外流入宿主細胞中，使宿主表現出所需要的性狀。因此理想的目的基因應不含多餘的幹擾成分、純度高，而且片段大小應適合重組操作。
最傳統的獲得外源基因方法是手槍克隆法（shortgun cloning）。若對細胞的基因信息一無所知，從細胞中提取的DNA分子用若幹種限製性內切酶切割成片段，將這些片段進行分離後分別克隆到宿主細胞進行表達，從表達產物中鑒別每一DNA片段的生物活性以確定是否含有所需要的目的基因。顯然這種方法的工作量非常大。
從20世紀60年代起，科學家就開展了測定DNA分子中核苷酸排列序列方法的研究工作，但是進展不大。1975年Sanger等人發明了加減法，能夠直接分析100～500個核苷酸的 DNA 片段，取得了DNA測序的重大突破。1977年Maxam和Gilbert等人發明了化學降解法，能夠更快速地分析DNA序列。同年Sanger等人又提出了雙脫氧鏈終止法，該方法能快速、準確、可靠地測量DNA序列，是目前DNA序列分析的重要手段。隨著計算機技術的快速發展，20世紀80年代實現了DNA的自動測序，從而人類能夠從各種生物體的 DNA中得到海量的序列信息，相繼完成了人類基因組、水稻基因組及許多微生物基因組的測序，為基因的發現、合成和分離奠定了物質基礎。通過幾十年來的努力和數據積累，世界上已經建立了多個基因庫和基因文庫。
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