生物滅菌指示劑（濕熱法）的原理和使用

一、生物滅菌指示劑

   生物滅菌指示劑是常用來檢測滅菌效果的方法之一，對於濕熱滅菌法，一般常用嗜熱脂肪地芽孢杆菌（也可使用其他等效耐熱的菌株）的芽孢進行測試。目前市場上已有多種品牌和形式的滅菌指示劑，常見的一般有紙片形式的和安瓿瓶（或其他玻璃管形狀）的產品。

  嗜熱脂肪地芽孢杆菌（原名嗜熱脂肪芽孢杆菌，後重新劃分歸屬於地芽孢杆菌屬，因此改名為嗜熱脂肪地芽孢杆菌）對熱有很強的耐受性，芽孢體耐熱性更強，因此常用其芽孢製作生物指示劑。嗜熱脂肪地芽孢杆菌最適生長溫度在55℃左右，大多數菌株生長溫度範圍在40℃-65℃，能發酵葡萄糖產酸，因此常用溴甲酚紫葡萄糖蛋白腖水（BCP）檢測其芽孢體是否存活。

二、生物指示劑的組成和製作

  若實驗室中有嗜熱脂肪地芽孢杆菌菌株，也可自行製作生物指示劑進行測試。首先將嗜熱脂肪地芽孢杆菌接種至錳鹽營養瓊脂平板（因培養溫度較高，培養時間較長，平板需厚一些，也可使用錐形瓶做大斜麵），55℃培養5-7天左右，可形成比較豐富的芽孢，將菌苔從平板上用生理鹽水或磷酸鹽緩衝液洗下，100℃加熱30min可殺死繁殖體留下芽孢，稀釋後可采用塗布或傾注法計數（通常使用DTA瓊脂，若沒有使用TSA也可以，置55℃培養24-48h），測定芽孢懸液濃度。

  將定量體積的芽孢懸液加入至紙片上幹燥處理，使紙片中含有的芽孢數大約在1-5×10⁶CFU即可，搭配溴甲酚紫葡萄糖蛋白腖水管即可進行滅菌效果測定了。也可以將芽孢懸液加入至定量體積的溴甲酚紫葡萄糖蛋白腖水中（通常可以用0.5-2mL，含芽孢量10⁶CFU）使用。製備好的指示劑可在2-8℃冰箱內冷藏。

三、滅菌生物指示劑的使用

  對於紙片的生物指示劑，放入滅菌鍋中按照固定程序滅菌後，將紙片放置於5mL的溴甲酚紫葡萄糖蛋白腖水管（通常商品化培養基已配備）中55℃培養不少於7天，若出現變黃反應，說明芽孢未被殺死，滅菌效果不達標。

  對於較大體積培養基的滅菌效果測試，則應考慮使用密封的玻璃管裝的滅菌指示劑放入培養基的內部進行監測，確認培養基的內部是否達到了相應的滅菌效果（特別是滅菌體積較大、容器密閉的情況下，更需要注意檢測容器內部是否達到了相應的滅菌效果）。密封的玻璃管裝滅菌指示劑使用後直接置於55℃培養不超過7天即可，觀察是否有變黃現象出現。未使用的保存管應置於冷藏保存（若儲存環境溫度過高會導致芽孢萌發，培養基變黃）。

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