三種支原體固體平板計數法

一、平板計數法的介紹

  現中國藥典對培養基靈敏度的檢查方法采用的是變色單位試驗法（CCU法），即是將肺炎支原體ATCC 15531、口腔支原體ATCC 23714分別接種至支原體肉湯、精氨酸支原體肉湯中，於36℃±1℃培養至培養基變色，盲傳兩代後，將培養物接種至待檢培養基中，做10倍係列稀釋，肺炎支原體稀釋至10^-7~10^-9，接種在支原體肉湯培養基內；口腔支原體稀釋至10^-3~10^-5，接種在精氨酸支原體肉湯培養基內。每個稀釋度接種3支試管，置36℃±1℃培養7d~14d，觀察培養基變色結果。

  美國藥典已舍棄了變色單位試驗法，現使用的是平板計數法（CFU法），即是向100mL液體培養基和至少9 mL固體培養基中接入不超過100CFU的支原體，接種的支原體至少包含一株葡萄糖發酵型菌株（肺炎支原體或等效菌株）以及一株精氨酸水解型菌株（口腔支原體），液體培養基於36℃±1℃密閉容器中培養，固體培養基於36℃±1℃、5%~10% CO₂、濕潤環境中培養。

  對比CCU和CFU法，顯然CFU法對支原體的培養要求更為苛刻。采用CFU法，可更直觀的觀察支原體的菌落形態，也可對支原體的菌數進行計算。

二、肺炎支原體、口腔支原體檢驗依據

  人肺炎支原體、豬肺炎支原體、口腔支原體液體培養的試驗方法依據於2020年版《中華人民共和國藥典》，以上支原體固體平板培養的試驗方法依據於《美國藥典》。以上支原體固體平板培養的方法以及染色方法可參考文章《人肺炎支原體、豬肺炎支原體、口腔支原體固體平板法及染色鏡檢》-點擊查看，這裏不再敘述。

  人肺炎支原體、豬肺炎支原體固體平板計數用培養基推薦如表1所示，不同點在於，人肺炎支原體培養應搭配馬血清或牛血清使用，豬肺炎支原體培養應搭配豬血清使用。

表1 肺炎支原體固體平板計數法推薦用培養基

培養基種類	品名	貨號	使用方法
即用型平板	肺炎支原體固體培養基平板	HBPM055	直接取用
瓊脂培養基	支原體瓊脂培養基	HB7025-3	高壓滅菌後倒板使用
肉湯培養基	支原體肉湯培養基	HB7025-2	添加瓊脂後滅菌倒板使用，瓊脂用量為10g/L
	腦心浸液肉湯（BHI）（疫苗專用）	HB8297-81

  口腔支原體固體平板計數用培養基如表2所示，口腔支原體應搭配馬血清或牛血清使用。

表2 口腔支原體固體平板計數法推薦用培養基

培養基種類	品名	貨號	使用方法
瓊脂培養基	支原體瓊脂培養基（含精氨酸）	HB7025-1	高壓滅菌後倒板使用
肉湯培養基	精氨酸支原體肉湯培養基	HB7025-5	添加瓊脂後滅菌倒板使用，瓊脂用量為10g/L

三、試驗方法

  本次肺炎支原體、口腔支原體固體平板計數法使用的培養基分別是BHI、精氨酸支原體肉湯。

  平板的配製方法參考文章《豬肺炎支原體在固體平板上的培養方法及染色鏡檢》，這裏不再敘述。使用BHI疫苗專用培養基肉湯、精氨酸支原體肉湯作為稀釋液，將肺炎支原體、口腔支原體原液梯度稀釋至10-9。

  人肺炎支原體固體平板計數法：吸取人肺炎支原體原液10^-1~10^-5稀釋液共六個濃度分別塗布至BHI瓊脂平板，塗布量為100 μL，10^-1~10^-9稀釋液與固體平板均放置於36℃±1℃培養箱中培養，培養7d~21d。這裏應注意，有條件的，需將平板置於5%~10%二氧化碳培養箱中正置培養，同時保持濕潤環境，沒有條件的，需使用封口膜對平板縫隙處進行封膜處理。

  豬肺炎支原體固體平板計數法：吸取豬肺炎支原體原液10^-1~10^-5稀釋液共六個濃度分別塗布至BHI瓊脂平板，塗布量為40μL（特製平板塗布量少較佳），10^-1~10^-9稀釋液與固體平板均放置於36℃±1℃培養箱中培養，培養7d~21d。這裏同人肺炎支原體固體平板培養的注意事項，此外，豬肺炎支原體較人肺炎支原體對潮濕環境的要求更高。

  口腔支原體固體平板計數法：吸取口腔支原體原液10^-1~10^-5稀釋液共六個濃度分別塗布至精氨酸支原體瓊脂平板，塗布量為100μL，10^-1~10^-9稀釋液與固體平板均放置於36℃±1℃培養箱中培養，培養7d~14d即可。口腔支原體較肺炎支原體易於培養。

四、人肺炎支原體計數結果

  如圖1所示，培養至13d時，人肺炎支原體稀釋液10^-1~10^-8稀釋管變至黃色。

圖1 人肺炎支原體稀釋液培養至13d

  培養至7d時，人肺炎支原體高濃度塗布平板可見支原體菌落，持續培養至17d時，低濃度平板上可見支原體菌落，10^-1~10^-4塗布平板如圖2所示。為更好的展示菌落形態，截取平皿表麵局部的菌落，此外，低濃度塗布平板表麵上的菌落不易拍照，需對光拍照。

10^-1                         10^-2

10^-3                         10^-4

        圖2 人肺炎支原體在固體平板上塗布的結果

  由圖2可知，10-4塗布平板表麵單菌落清晰可見（肉眼觀察較圖片更為清晰），可進行精確計數，10^-4平板表麵菌落均數為230個（應注意圖片為平板表麵局部圖，並非展示了所有菌落），該菌數是由10^-4稀釋液塗布100μL菌液得到的，由於稀釋液體係為10mL，則可推算1mL原液菌數為2.3×10⁷CFU人肺炎支原體，則10^-8稀釋液理論接入了約2CFU人肺炎支原體，10^-9稀釋液未有菌接入，結合圖1可知，添加約2CFU人肺炎支原體可使支原體肉湯培養至13d時有顏色變化。

  應注意的是，由於梯度稀釋存在一定的誤差，若振蕩不均勻，可能導致10^-8稀釋管未有菌接入，結果即是無論延長培養多少天，10^-8稀釋管均不會發生變色；誤差也可能導致10^-9接入了菌，結果即是延長培養一定天數後，10^-9稀釋管也會發生顏色變化。

  為驗證該菌落為人肺炎支原體，對該菌落進行染色，染色鏡檢圖片如圖3所示。

圖3 人肺炎支原體染色鏡檢

五、豬肺炎支原體計數結果

如圖4所示，培養至12d時，豬肺炎支原體稀釋液10^-1~10^-9稀釋管變至黃色。

圖4 豬肺炎支原體稀釋液培養至12d

  培養至7d時，豬肺炎支原體高濃度塗布平板可見支原體菌落，持續培養至14d時，低濃度平板上可見支原體菌落，10^-2~10^-5塗布平板如圖5所示。為更好的展示菌落形態，截取平皿表麵局部的菌落，此外，低濃度塗布平板表麵上的菌落不易拍照，需對光拍照。

 10^-2                         10^-3

10^-4                         10^-5

        圖5 豬肺炎支原體在固體平板上塗布的結果

  由圖5可知，10^-5塗布平板表麵單菌落清晰可見（肉眼觀察較圖片更為清晰），可進行精確計數，10^-5平板表麵菌落均數為140個（應注意圖片為平板表麵局部圖，並非展示了所有菌落），該菌數是由10^-5稀釋液塗布40μL菌液得到的，由於稀釋液體係為10mL，則可推算1mL原液菌數為3.5×10⁸CFU豬肺炎支原體，則10^-9稀釋液理論接入了約4CFU豬肺炎支原體，結合圖4可知，添加約4CFU豬肺炎支原體可使支原體肉湯培養至12d時有顏色變化。

  為驗證該菌落為豬肺炎支原體，對該菌落進行染色，染色鏡檢圖片如圖6所示。

圖6 豬肺炎支原體染色鏡檢

六、口腔支原體計數結果

  如圖7所示，培養至8d時，口腔支原體稀釋液10^-1~10^-7稀釋管變至粉紅，延長培養至12d時，10^-8稀釋管也變至粉紅。

圖7 口腔支原體稀釋液分別培養至8、12d

  培養至3d~5d，口腔支原體高濃度塗布平板可見支原體菌落，持續培養至8d時，低濃度平板上可見支原體菌落，10^-1~10^-4塗布平板如圖8所示。為更好的展示菌落形態，截取平皿表麵局部的菌落。

10^-1                         10^-2

10^-3                         10^-4

圖8口腔支原體在固體平板上塗布的結果

  由圖8可知，10^-4塗布平板表麵單菌落清晰可見（肉眼觀察較圖片更為清晰），可進行精確計數，10^-4平板表麵菌落均數為172個（應注意圖片為平板表麵局部圖，並非展示了所有菌落），該菌數是由10^-4稀釋液塗布100μL菌液得到的，由於稀釋液體係為10mL，則可推算1mL原液菌數為1.72×10⁷CFU口腔支原體，則10^-8稀釋液理論接入了約2CFU口腔支原體，添加17CFU口腔支原體可使精氨酸支原體肉湯培養至8d時有顏色變化，添加約2CFU口腔支原體可使精氨酸支原體肉湯培養至12d時有顏色變化。

  若培養相同時間，口腔支原體較肺炎支原體菌落要大許多，將10^-4稀釋濃度塗布的平板延長培養至14d，口腔支原體的菌落狀態如圖9所示。

圖9 延長培養至14d的平板表麵的口腔支原體

  為驗證該菌落為口腔支原體，對該菌落進行染色，染色鏡檢圖片如圖10所示。

圖10 口腔支原體染色鏡檢

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