抗體蛋白含量測定試劑

  蛋白質的定量方法很多,比較精確的為微量凱氏定氮法，但操作比較麻煩,故一般實驗室多用以下3種方法:雙縮脲法、Folin酚法和紫外光譜吸收法。

(一)雙縮脲法

【原理】

  蛋白質中含有肽鏈[-NH-CO-]與雙縮脲試劑中的堿性酒石酸鉀鈉銅鹽作用,形成紫色化合物,肽鏈愈多,形成的紫色愈深。其顯色的程度可用比色法測定

【成分】

酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·2H2O)	9.0g
硫酸銅(CuSO4·5H2O)	3.0g
碘化鉀	5.0g
0.2N 氫氧化鈉溶液	400ml
2N氫氧化鈉溶液	1000ml

【製法】

  將酒石酸鉀鈉和硫酸銅溶解於400ml0.2N氫氧化鈉溶液中,然後加入碘化鉀,以2N氫氧化鈉溶液加至1000ml,放入棕色試劑瓶密蓋,置於室溫暗處保存備用。

 (二)Folin 酚法

【原理】

  此法亦為比色法,係根據Folin酚試劑與蛋白在堿性溶液中反應,因蛋白量不同而顯色程度不同的原理。其顯色程度決定於酪氨酸和色氨酸與Folin酚試劑的反應。

【成分】

硫酸鈉(Na2SO4·2H2O)	100.0g
鉬酸鈉(NaMOO4·2H2O)	25.0g
雙蒸水	1350.0ml
85%磷酸	50.0ml
濃鹽酸	100.0ml
硫酸鋰	50.0g
液體溴	數滴
氫氧化鈉	0.40g
碳酸鈉	2.0g
枸櫞酸鈉(Na3C6H5O7·2H2O)	1.0g
硫酸銅(CuSO4·5H2O)	0.5g

【製法】

  1.Folin酚試劑製備:依次加入硫酸鈉、鉬酸鈉、雙蒸水100ml、85%磷酸和濃鹽酸試劑於一容器中,煮沸1小時。然後再順序加入硫酸鋰、雙蒸水50.0ml、液體溴數滴,重新煮沸15分鍾,以除去殘餘,冷卻後加雙蒸水至1000.0ml，用濾紙過濾後,裝入棕色瓶密蓋,置室溫暗處保存備用(試劑“1”)

  2.2%碳酸鈉溶液的製備:將氫氧化鈉0.4g加雙蒸水至100.0ml,溶解後,再加入2.0g碳酸鈉,溶解後放入試劑瓶內保存備用(試劑“2”)。

  3.0.5%硫酸銅溶液的製備:將1.0g枸櫞酸鈉加雙蒸水至100.0ml,溶解後,再加入0.50g硫酸銅,溶解後放入試劑瓶內保存備用(試劑“3”)。

  4.混合試劑的製備:取1ml試劑“3”加50.0ml試劑“2”充分混合即可備用(試劑“4”)。

  5.1/3的Folin酚試劑的製備:1份Folin試劑“1”加2份雙蒸水充分混均即可備用(試劑“5”)。

【用法】

  取0.1~0.2ml待測蛋白溶液,加1ml試劑“4”(混合試劑),置室溫10分鍾,然後加入0.1ml試劑“5”,充分混合,分別在30分鍾和2小時後,各在500.0或750.0mμ波長讀數。

  樣品測定前需以各種已知濃度的標準蛋白溶液在500.0或750.0mμ波長測光密度,以製出蛋白濃度對光密度的函數圖。

【用途】

  用於抗體蛋白含量的測定

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