③核苷酸序列分析從本章第一節可以看出，16SRNA大分子在生物進化研究中起著重要的作用。伍斯就是根據對60株細菌的16SRNA的核苷酸序列分析研究後，提出了生命的第三種形式———古細菌。16SrRNA序列同源性的應用不僅發現了古細菌，同時還揭示了細菌域各群間的係統發育關係，修正了許多細菌的分類地位，提出了不同於傳統細菌分類體係的新的分類係統。新的分類係統體現了微生物分類的研究從表觀特征向係統發育體係的發展。新的細菌分類係統與傳統的細菌分類體係相比，也存在較多的差異，這主要表現在：
a、 改變了細胞壁結構作為親緣關係劃分的標誌之一，如無細胞壁的支原體，實際是革蘭氏陽性的芽孢梭菌的一個後代分支。
b、改變了營養類型作為種係發生的特征，如光合細菌並非是獨立於非光合種群的進化分支，而是每種光合種群都代表了一個高階的分類單元，其後代分支包括非光合細菌。
c、盡管革蘭氏陽性細菌是係統發育關係密切的一群細菌，但革蘭氏陰性菌卻包括了10個亞群。
應用16SrRNA核苷酸序列分析法進行微生物分類鑒定，首先要將微生物進行培養，然後提取並純化16SrRNA，進行16SRNA序列測定，獲得各相關微生物的序列資料，再輸入計算機進行分析比較，由計算機分析微生物之間係統發育關係並確定其地位。
16SrRNA核苷酸序列測定和分析方法可分兩類：16SrRNA寡核苷酸編目分析法和16SrRNA全序列分析法。
16SrRNA寡核苷酸編目分析法的大致做法如下：從培養的微生物中提取並純化16SrRNA，再將純化的16SrRNA用核糖核酸酶（如T1核酸酶）處理，水解成片段，並用同位素體外標記（也可以在培養微生物時進行活體標記），然後用雙向電泳層析法，分離這些片段，用放射自顯影技術確定不同長度的寡核苷酸斑點在電泳圖譜中的位置，根據寡核苷酸在圖譜中的位置，小片段的寡核苷酸分子序列即可確定。對於不能確定序列的較大片段核苷酸，還需要把斑點切下，再用不同核糖核酸酶或堿水解，進行二級分析，有的可能還要進行三級分析，直至弄清所有片段的序列為止。在此基礎上，對6個或更多核苷酸的片段按不同長度進行編目。將所有要比較的微生物的序列目錄編好後，即可對這些序列目錄資料進行分析比較，采用相似性係數法比較各微生物之間的親緣關係。相似性係數法是通過計算相似性係數SAB值來確定微生物之間的關係。
如果SAB等於1，說明所比較的兩菌株rRNA序列相同，兩菌株親緣關係相近，若SAB值小於0.1，則表明親緣關係很遠。
寡核苷酸編目分析法隻獲得了16SrRNA分子的大約30%的序列資料，加上采用的是一種簡單相似性的計算方法，所以其結果有可能出現誤差，應用上受到一定限製。隨著核酸序列分析技術的發展，20世紀80年代末又陸續發展了一些rRNA全序列分析方法，其中最常用的是直接序列分析法。這種方法用反轉錄酶和雙脫氧序列分析，可以對未經純化的rRNA抽提物進行直接的序列測定。
上一篇：微生物鑒別方法—新技術新方法—分子生物學方法2，2
下一篇：微生物鑒別方法—數值分類法
