一、大腸菌群多管發酵法測定
1定義
大腸菌群（coliform bacteria）係指一群在36±1℃培養24h能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞杆菌。
2 儀器
見《公共場茶具的大腸菌群測定方法》。
3培養基和試劑
3.1乳糖蛋白腖培養液
3.1.1成分：蛋白腖 10g
牛肉膏 2g
乳糖 5g
氯化鈉 5g
1.6%（V/V）溴甲酚紫乙醇溶液 1mL
蒸餾水 1000mL
三倍濃縮乳糖蛋白腖培養液按上述乳糖蛋白腖培養液濃縮三倍配製。
3.1.2配法：將蛋白腖、牛肉膏、乳糖及氯化鈉置於1000ml蒸餾水中加熱溶解，調pH到]7.2～7.4。再加入1ml 1.6%溴甲酚指示劑，充分混勻，分裝到含有倒管的試管中，115℃高壓滅菌15min。
3.2伊紅美蘭瓊脂
見《公共場所茶具的大腸菌群測定方法》。
3.3革蘭氏染色液
風《公共場所茶具的大腸菌群測定方法》。
3.4染色法
見《公共場所茶具的大腸菌群測定方法》。
4推測性試驗
4.1在2個裝有50ml三倍濃縮乳糖膽鹽培養液的大試管或燒杯內各加入水樣100ml。
4.2在10支裝有5ml三倍濃縮乳糖膽鹽培養液的試管裏各加入水樣10ml。
4.3輕搖試管，使液體充分混勻，置36±1℃培養箱中，培養24h。
4.4觀察每管是否產氣，如不產氣則報告為大腸菌群陰性；若有氣體產生則為推測性試驗陽性，需做進一步的證實試驗。
5證實試驗
5.1平板分離
自推測性檢驗陽性管中取一接種環培養液，接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃培養箱培養18～24h，觀察菌落形態，典型的大腸菌群菌落為黑紫色或紅紫色，具有金屬光澤。
5.2複發酵試驗
挑取可疑大腸菌群菌落1或2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，於36±1℃培養箱中，培養24h。
5.3凡乳糖發酵管最終產酸產氣，革蘭氏染色為陰性的最大可能數（MPN）檢索表得出1000ml水樣中總大腸菌群的MPN值。
總大腸菌群（MPN）檢索表
100mL水量的陽性管數
100mL水量的陽性管（瓶）數
0 1 2
每L水樣中總大腸菌群 每L水樣中總大腸菌群數 每L水樣中總大腸菌群數
二、大腸菌群濾膜法測定
1 定義
大腸菌群（coliform bacteria）為需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞杆菌，將帶菌濾膜貼在含乳糖的選擇性培養基上，經37℃培養24小時後，呈現深暗紅色帶金屬光澤的菌落。
2儀器
2.1濾器
2.2濾膜:乳徑0.45m m。直徑根據濾器規格，目前常用的有35mm和27mm兩種。
2.3抽濾設備
2.4無齒鑷子
2.5其它儀器見《公共場所茶具的大腸菌群檢驗方法》
3培養基
3.1品紅亞硫酸鈉培養基
3.1.1成分：蛋白腖 10g
酵母浸膏 5g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
瓊脂 10～20g
磷酸氫二鉀 3.5g
無水亞硫酸鈉 5g
5%堿性品紅乙醇溶液 20mL
蒸餾水 1000mL
3.1.2儲備培養基的製備
將磷酸氫二鉀、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白腖加到含有900ml蒸餾水的燒杯中，溶解後調pH值到7.2～7.4，加入瓊脂加熱溶解，用蒸餾水補足至1000ml，趁熱用脫脂棉或絨布過濾，再加入乳糖，混勻後定量分裝於燒瓶內， 115℃高壓滅菌20min，置冷暗處備用。
3.1.3平皿培養基的製備
將上述培養基加熱融化，根據培養基的用量，堿性品戲乙醇溶液與培養基按1：50的比例，用滅菌吸管吸取一定量的堿性品紅溶液置於滅菌空試管中。再按1：200的比例稱取所需的無水亞硫酸鈉置於另一個來菌空試管內，加滅菌水少許使其溶解，在沸水浴中煮沸滅菌10min。
用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加於堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉紅色為止。將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加入已融化的儲備培養基中，並充分混勻（防止產生氣泡），立即將此種培養基適量傾入滅菌的空平皿內， 待其冷卻凝固後置冰箱內備用。此培養基於冰箱中保存不宜超過兩周，如培養基已由淡紅色變成深紅色，則不能再用。
3.2乳糖蛋白腖培養液
見《遊泳池水中大腸菌群多管發酵測定法》
4操作步驟
4.1濾膜滅菌：將濾膜放入含蒸餾水的燒杯中，煮沸滅菌三次，每次15min。前兩次煮混後需更換水洗滌2～3次，以除去留溶劑。
4.2濾器滅菌：用121℃高壓滅菌20min或用點燃的酒精棉球火焰滅菌。
4.3水樣過濾：用無菌鑷子夾滅菌濾膜邊緣部分，將濾膜粗糙麵向上，貼放在濾床上。固定好濾器，將100ml水注入濾器中,打開濾器閥門。在-0.5大氣壓下抽濾。
4.4培養：水樣濾室外後，再抽氣約5s，關上濾器閥門，取下濾器。用滅菌鑷子夾濾膜邊緣部分，移放在乳糖瓊脂分離培養基上，濾膜截留細菌麵向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者之間不得留有氣泡。然後將平皿倒置，放入36±1℃恒溫箱內培養18～24h。
4.5挑取濾膜上符合下列特征的菌落進行革蘭氏染色，鏡檢。
紫紅色，具有金屬光澤的菌落；
深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落；
淡紅色，中心色較深的菌落。
4.6將革蘭氏染色為陰性的無芽胞杆菌接種到乳糖蛋白腖培養液中，於36±1℃培養48h。產酸產氣者證實為大腸菌群陽性。
5檢驗結果報告
計算濾膜上生長的證實為大腸菌群的菌落數，再乘以10即為每1000ml水樣中的大腸菌群數。
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