化妝品微生物標準檢驗方法金黃色葡萄球菌及注解
中華人民共和國國家標準
化妝品微生物標準檢驗方法金黃色葡萄球菌 UDC 668：576 .85.07
(GB7918.5－87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics
Staphylococcus aureus
金黃色葡萄球菌在外界分布較廣，抵抗力也較強能引起人體局部化膿性病灶，嚴重時可導致敗血症，因此化妝品中檢驗金黃色葡萄球菌有重要意義。
1 方法提要
根據本菌特有的形態及培養物質性，應用Baird Parker平板進行分離，該平板中的氯化鋰可抑製革蘭氏陰性細菌生長，丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長，以提高檢出率，並利用分解甘露醇和血漿凝固酶等特征，以茲鑒別。
2 培養基和試劑
2.1 培養基
2.1.1 SCDLP液體培養基
見GB 7918.1 - 87《化妝品微生物標準檢驗方法 總則》。
2.1.2 7.5％的氯化鈉肉湯
成分：蛋白腖 10g
牛肉膏 3g
氯化鈉 75g
蒸餾水 1000ml
製法：將上述成分加熱溶解，調pH為7.4，分裝，121℃(15 1b)15min高壓滅菌。
2.1.3 Baerd Parker 平板
成分： 胰蛋白腖 10g
牛肉膏 5g
酵母浸膏 1g
丙酮酸鈉 10g
甘氨酸 12g
氯化鋰(LiCl·6H2O) 5g
瓊脂 20g
蒸餾水 950ml
pH7.0±0.2
增菌劑的配製：30％卵黃鹽水50ml與除菌過濾的1％亞碲酸鉀溶液10ml&127;混合，保存於冰箱內。
製法：將各成分到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至25℃校正pH。分裝每瓶95ml，121℃高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂，每95ml加入預熱到50℃的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5ml，搖勻後傾注平板。培養基應是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過48h。
2.1.4 血瓊脂培養基
成分：營養瓊脂 100ml
脫纖維羊血(或兔血) 10ml
製法：將營養瓊脂加熱溶化，待冷至50℃左右以無菌手續加入脫纖維羊血，搖勻，製成平板，置冰箱內備用。
2.1.5 甘露醇發酵培養基
成分： 蛋白腖 10g
氯化鈉 5g
甘露醇 10g
牛肉膏 5g
0.2％溴麝香草酚藍溶液 12ml
蒸餾水 1000ml
製法： 將蛋白腖、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調pH7.4，加入甘露醇和指示劑，混勻後分裝試管中，115℃(10 1b)20min滅菌備用。
2.1.6 兔(人)血漿製備
取3.8％檸檬酸鈉溶液〔121℃(15 1b)30min滅菌〕1份加兔(人)全血4份，混勻靜置，2000～3000r/min離心3～5min。血球下沉，取上麵血漿。
3 設備和材料
3.1 顯微鏡。
3.2 培養箱。
3.3 離心要。
3.4 滅菌吸管：1ml，5ml，10ml。
3.5 滅菌試管。
3.6 載玻片。
3.7 酒精燈。
4 操作步驟
4.1 增菌：取1：10稀釋的樣品10ml接種到90mlSCDLP液體培養基中(如無此培養基也可用7.5％氯化鈉肉湯)，置37℃培養箱， 培養24h。(1)
注：如無此培養基也可用7.5％氯化鈉肉湯，檢驗含防腐劑的化妝品時，可在 1000ml此培養基中加1g卵磷脂、7g吐溫80。
4.2 分離：自上述增菌培養液中，取1～2接種環，劃線接種在Baird Parker氏培養基，如無此培養基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37℃培養24～48。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表麵光滑，周圍有溶血圈。在Baird Parker 氏培養基上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為2～3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置37℃培養24H。
4.3 染色鏡檢：挑取分純菌落，塗片，進行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5～1μm。
4.4 甘露醇發酵試驗：取述分純菌落接種到甘露醇發酵培養基中，置37℃培養24h，金黃色葡萄球菌應能發酵甘露醇產酸。
4.5 血漿凝固酶試驗
4.5.1 玻片法：取清潔幹燥載玻片，一端滴加一滴滅菌生理鹽水，另一端滴加一滴血漿，用接種環挑取待檢菌落，分別在生理鹽水及血漿中充分研磨混合。血漿與菌苔混懸液在5min內出現團塊或顆粒狀凝塊時，而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固現象者為陽性，如兩者均無凝固現象則為陰性。凡玻片試驗呈陰性反應或鹽水滴與血漿滴均有凝固現象，再進行試管凝固酶試驗。
4.5.2 試管法：吸取1：4新鮮血漿0.5ml，放入滅菌小試管中，再加入待檢菌24h肉湯培養物0.5ml。混勻，放37℃溫箱或水浴中，每半小時觀察一次，24h之內如呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養物及肉湯培養基各0.5ml 1：4血漿混勻，做為對照。
5 檢驗結果報告
凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長，經染色鏡檢，證明為革蘭氏陽性葡萄球菌，並能發酵甘露醇產酸。血漿凝固酶試驗陽性者，可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。
附加說明：
本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所歸口。
本標準由“化妝品微生物標準檢驗方法”起草小組起草。
本標準主要起草人劉以賢。
本標準由中國預防醫學科學院環境衛生監測所負責解釋
注解:
（1）增菌培養
本標準方法用SCDLP增菌液增菌，其成分中含有中和劑，抑菌效果較差，雜菌生長較多。在增菌培養基中加適量的亞碲酸鉀（鈉），當金黃色葡萄球菌生長時可將其還原，變為黑色，使培養液增加堿性；亞碲酸鉀（鈉）並可與蛋白腖中含硫氨基酸結合，形成的亞碲酸與硫的複合物，有抗細菌硫源代謝作用，因而可抑製其他細菌生長繁殖。
（2）分離培養
分離金黃色葡萄球菌的培養基有（Vogel-Johnson瓊脂、Baird Parker瓊脂、血瓊脂、卵黃高鹽瓊脂、TMP瓊脂等、CTFA、FDA和日本的方法均用Vogel-Johson瓊脂培養基。我國食品微生物標準檢驗方法規定Baird Parker瓊脂和血瓊脂培養基。Vogel-Johnson瓊脂和Baird-Parker瓊脂的基本成分類似。為尊重傳統習慣用法，在化妝品標準檢驗方法中隻選用Baird-Parker和血瓊脂二種培養基。現將各分離鑒別培養基的主要成分，作用機製和注意事項介紹如下：
1） Baird-Parker和Vogel-Johnson瓊脂培養基中的氯化鉀可抑製革蘭氏陰性菌生長，丙酮酸鈉可刺激金黃色葡萄球菌生長，以提高檢出率。
2）血瓊脂不僅適應金黃色葡萄球菌的生長，菌落較大，顏色鮮明，而且有鑒別溶血反應的作用，可作為血凝固酶試驗的補充，增加致病菌株的檢出機會。
3）卵黃高鹽瓊脂、氯化鈉用量較大，滲透壓高，有抑製某些細菌的生長作用。卵黃中的卵磷脂，有促進金黃色葡萄球菌的生長發育和鑒別的作用。該菌的卵磷脂酶可分解卵磷脂，因而生長的典型菌落，表麵周圍有月暈狀油膜，底部有乳濁圈，易於鑒別，本培養基抑菌作用較小，雜菌生長較多。
表4金葡萄球菌的菌落特征
培養基
菌落特征
Baird-Parker瓊脂
圓形隆起，光滑，直徑為2～3mm，呈灰色到黑色，邊緣色淡，周圍為一混濁帶，外層有一透明帶。
血瓊脂
金黃色，圓形隆起，邊緣整齊，外周有透明的深血環，直徑為1～2mm。
卵黃高鹽
金黃色，圓形隆起，邊緣整齊，直徑為1～2mm，外周有卵磷脂被分解的乳濁圈。
TMP瓊脂
金黃色，圓形隆起，邊緣整齊，直徑0.7～1mm,周圍有黃色環。
4）TMP瓊脂：加有適量亞碲酸鉀，多量氯化鈉以及甘露醇和酚紅指示劑，抑製雜菌的作用較強，應適當加大接種量，取3～5環增菌液劃線。金黃色葡萄球菌可還原亞碲酸鉀使之變黑，並可發酵甘露醇產酸，使指示劑變黃，以致菌落呈墨黑色，周圍有黃色環，容易鑒別。亞碲酸鉀的用量應注意準確，因其抑菌力較強，對金黃色葡萄球菌的生長也有一定影響，因而菌落較小。
（3）糖發酵試驗：多數葡萄球菌菌株分解葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、產酸不產氣，致病性葡萄球菌在厭氧條件下分解甘露醇、產酸，非致病性葡萄球菌無此作用。
（4）血漿凝固酶試驗
試管法是檢測葡萄球菌的胞外遊離血漿凝固酶（作用於凝固酶原）。
玻片法是檢測結合血漿凝固酶（作用於纖維蛋白原）。此法快速、簡便，大多數中間型葡萄球菌和豬葡萄球菌呈陰性反應。金黃色葡萄球菌中有10～15％可呈陰性反應。
有學者推薦乳膠凝集試驗作為快速及常規檢驗方法。將1:8稀釋的乳膠、懸液與等量人血漿（用EDTA處理後，經甘氨酸。鹽酸緩衝液作1:1000稀釋）混合製成乳膠製劑。試驗時將待檢菌置於加鹽水的玻片上，再加一滴乳膠試劑，混勻觀察結果，凝集則為血漿凝固酶陽性。本法的準確如同試管法。
（5）檢驗報告
1）按常規程序檢驗，凡分離出革蘭氏陽性葡萄球菌的疑似菌落，經證實可發酵甘露醇、血漿凝固酶陽性的菌株，可報告檢出金黃色葡萄球菌。
2）如果分離的疑似菌落不發酵甘露醇，但血漿凝固酶陽性也可斷定為檢出金黃色萄葡球菌。
3）分離出的葡萄球菌疑似菌落，不發酵甘露醇、血漿凝固醇陰性，判斷未檢出金黃色葡萄球菌。
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