(1)改良Ryn鞭毛染色法
①玻片的處理。要求用新的載玻片,用前須在95%酒精中浸泡24h以上,用時從酒精中取出,以幹淨紗布擦幹後使用。
②在玻片上滴蒸餾水兩滴。1張玻片上可同時製2個塗片。
③用接種環挑取血平板上菌少許,將細菌點在玻片上的蒸餾水滴的頂部,一般隻需點一下,隻允許極少量的細菌進入水滴,不可攪動,以免鞭毛脫落。
④玻片置室溫自然幹燥 。
⑤滴加染液於玻片上染色。
⑥約10—15min後,用自來水緩慢衝去染液,衝洗時應避免染液表麵的金屬光澤膜滯留在玻片上,影響鏡檢。
⑦玻片自然幹燥後,鏡檢時應以塗片的邊緣開始,逐漸移向中心。原因是邊緣細菌較少且相互分開,鞭毛容易觀察。細菌密集的地方鞭毛被菌體擋住,不易觀察。
結果:菌體和鞭毛均染成淡紫色。
(2)硝酸銀染色法
①活化菌種。冰箱中保存的菌種,通常要連續移種1—2次後,接種於新配製的營養瓊脂斜麵(表麵較濕潤、基部有冷凝水),28—32°培養10—14h,取斜麵和冷凝水交接處培養物作染色材料;或點種於新製備的營養瓊脂(含8—10g/l的瓊脂 )平板中央,28—32°培養18—30h,讓菌種擴散生長,取菌落邊緣的菌苔(不要取菌落 中央的菌苔 )作染色材料。
②製備菌液。取斜麵或平板菌種培養物數環於盛有1—2ml無菌水的試管中,製成輕度渾濁的菌懸液用於製片。也可用培養物直接製片,但效果往往不如先製備菌液好。
③製片。取一滴菌液於載玻片的一端,然後將玻片傾斜,使菌液緩緩流 向另一端,用吸水紙吸去玻片下端多餘菌液,室溫(或 162溫室)自然幹燥 。幹後應盡快染色。
④染色。滴加硝酸銀染色A液,染3—5min,用蒸餾水充分洗去A液。用B液衝去殘水後,再加B液覆蓋塗片染色約數秒至1min,當塗麵出現明顯褐色時,立即用蒸餾水衝洗。若加B液後顯色較慢,可用微火加熱,直至顯褐色時立即水洗。自然幹燥 。
⑤鏡檢。用油鏡觀察。觀察時,可從玻片的一端逐漸移至另一端,有時隻在塗片的一定部位觀察到鞭毛。
結果:菌體呈深褐色,鞭毛顯褐色。
(3)改良的Leifson染色法
①活化菌種同硝酸銀染色法。
②製片。用記號筆在載玻片反麵將玻片分成3—4個等分區,在每一小區的一端放一小滴菌液。將玻片傾斜,讓菌液流到小區的另一端,用濾紙吸去多餘的菌液。室溫或37°, 自然幹燥 。
③染色。加Leifson染色液覆蓋第一區的塗麵,數分鍾後,加染液於第二區塗麵,如此繼續染第三區、第四區。在染色過程中注意觀察,當整個玻片都出現鐵鏽色沉澱、染料表麵出現金色膜時,直接用水輕輕衝洗(不要先傾去染料再清洗,否則背景不清 ),染色時間大約10min。
④鏡檢。自然幹燥後,油鏡檢查。
結果:菌體和鞭毛均呈紅色。
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