USP對過熱滅菌工藝的定義是指能使D值不小於1min的微生物至少下降12個對數單位的滅菌工藝。對一般的液體產品而言，在121℃滅菌15min即被認為過熱滅菌工藝。但對管路、膠塞、織物以及過濾器等熱穿透性較差的物品則需要更長的滅菌時間或更高的滅菌溫度，方能達到過熱滅菌要求。用作生物指示劑的微生物芽孢應具有良好的耐熱性並且耐熱性也相對比較穩定。
根據滅菌工藝對微生物的強熱致死效應，通常選用D值不低於1.5—3min的嗜熱脂肪芽孢杆菌芽孢（每個指示劑的芽孢含量通常在10（5）—10（7）之間）作為生物指示劑對過熱滅菌工藝進行驗證。該類指示劑在FO值低於其存活時間（D值*芽孢的對數值-2）時，應當能全部呈陽性結果；當FO值高於其殺滅時間（D值*芽孢的對數值+4）時，所有的生物指示劑均應呈陰性結果。
對FO值為15min的滅菌工藝（藥典推薦的常用滅菌工藝），可選用D值為1.5min、芽孢含量為10（6）個的微生物指示劑，或其他耐熱性相當的微生物指示劑，對其進行驗證。
根據被滅菌物品的性質來確定所選用不同包裝方式的微生物指示劑。滅菌溶液時，多選用 自含型安瓿微生物指示劑；滅菌織物時，多選用芽孢條；滅菌管路時，則可能要選用特殊生物指劑（如用接有芽孢的鋼絲、線等）以測試死角處（最冷點）的滅菌情況。
選擇時，首先，要掌握滅菌前產品中汙染菌狀況，包括汙染菌的數量及其耐熱性；其次，測定生物劑在待驗證產品及驗證用標準溶液中耐熱性（D值和F值）；最後，根據產品的最低滅菌工藝條件、滅菌前產品中的汙染菌控製要求及最終產品的無菌保證要求，
用相關公式計算出驗證時每個生物指示劑所需要的孢子數量。
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