【GB/T 16347—1996】 乳酸菌飲料中乳酸菌的微生物學檢驗
1 主題內容與適用範圍
本標準規定了乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗的技術要求。
本標準適用於以鮮乳、乳粉或輔以大豆等為原料，經乳酸菌發酵加工製成的具有相應風味的活性乳酸菌飲料。
2 引用標準
GB 4789.28 食品衛生微生物學檢驗 染色法、培養基和試劑
3 術語
乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖產生乳酸，需氧和兼性厭氧，多數無動力，過氧化氫酶陰性，革蘭氏陽性的無芽胞杆菌和球菌。
乳酸菌菌落總數：檢樣在一定條件下培養後，所得1mL檢樣中所含乳酸菌菌落的總數。
4 設備和材料
4.1 溫箱：36±1℃。
4.2 冰箱：0～4℃。
4.3 恒溫水浴：46±1℃。
4.4 電爐：可調式。
4.5 吸管：容量為1，10和25mL。
4.6 廣口瓶或三角瓶：容量為500mL。
4.7 平皿：直徑為9cm。
4.8 試管：18×180mm。
4.9 顯微鏡。
5 培養基和試劑
5.1 改良TJA培養基(改良番茄汁瓊脂培養基)。
5.2 改良MC培養基(Modified Chalmers培養基)。
5.3 0.1%美蘭牛乳培養基。
5.4 6.5%氯化鈉肉湯。
5.5 pH9.6葡萄糖肉湯。
5.6 40%膽汁肉湯。
5.7 澱粉水解培養基。
5.8 精氨酸水解培養基。
5.9 乳酸杆菌糖發酵管。
5.10 七葉苷培養基。
5.11 革蘭氏染色液：按GB 4789.28規定執行。
5.12 3%過氧化氫溶液：按GB 4789.28規定執行。
5.13 蛋白腖水、靛基質試劑：按GB 4789.28規定執行。
5.14 明膠培養基：按GB 4789.28規定執行。
5.15 硝酸鹽培養基、硝酸鹽試劑：按GB 4789.28規定執行。
5.16 生理鹽水：定量分裝於三角瓶和試劑管內滅菌。
6 乳酸菌菌落總數的測定
6.1 檢驗程序
乳酸菌菌落總數檢驗程序如下：
（略）
6.2 操作步驟
6.2.1 以無菌操作將經過充分搖勻的檢樣25mL(或25g)放入含有225mL滅菌生理鹽水的滅菌廣口瓶內作成1∶10的均勻稀釋液。
6.2.2 用1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液)。
6.2.3 另取1mL滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用1支1mL滅菌吸管。
6.2.4 選擇2～3個以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液於滅菌平皿內，每個稀釋度作兩個平皿。
6.2.5 稀釋液移入平皿後，應及時將冷至50℃的乳酸菌計數培養基(改良TJA或改良MC)注入平皿約15mL，並轉動平皿使混合均勻。同時將乳酸菌計數培養基傾入加有1mL稀釋液檢樣用的滅菌生理鹽水的滅菌平皿內作空白對照，以上整個操作自培養物加入培養皿開始至接種結束須在20min內完成。
6.2.6 待瓊脂凝固後，翻轉平板，置36±1℃溫箱內培養72±3h取出，觀察乳酸菌菌落特征(見表1)，選取菌落數在30～300之間的平板進行計數。計算後，隨機挑取5個菌落數進行革蘭氏染色，顯微鏡檢查並做過氧化氫酶試驗。革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽胞的球菌或杆菌可定為乳酸菌。根據證實為乳酸菌菌落計算出該皿內的乳酸菌數，然後乘其稀釋倍數即得每毫升樣品中乳酸菌數。例如，檢樣10－4的稀釋液在改良TJA瓊脂平板上，生成的可疑菌落為35個，取5個鑒定，證實為乳酸菌的是4個，則1mL檢樣中乳酸菌數為：
6.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培養基上菌落生長形態特征見表1。
表1 乳酸菌在不同培養基上菌落特征
（表略）
7 乳酸菌的鑒定
對上述分離到的乳酸菌需進行菌種鑒定時，則作以下試驗。
7.1 菌種製備：自平板上挑取菌落，接種於改良TJA或改良MC瓊脂斜麵，於36±1℃，24～48h培養，刮取菌苔，分別進行下列試驗。
7.2 乳酸杆菌鑒定試驗：極少見還原硝酸鹽，不液化明膠，不產生靛基質和硫化氫。
7.3 常見乳杆菌屬內種的碳水化合物反應，見表2。
7.4 產乳酸的鏈球菌的鑒別試驗，見表3。
表2 常見乳杆菌屬內種的碳水化合物反應
（表略）
表3 乳酸的鏈球菌的鑒別表
（表略）
附錄A
數種專用培養基及試劑
(補充件)
A1 改良TJA培養基(改良番茄汁瓊脂培養基)
A1.1 成分
番茄汁 50mL
酵母抽提液 5g
肉膏 10g
乳糖 20g
葡萄糖 2g
K2HPO4 2g
吐溫80 1g
乙酸鈉 5g
瓊脂 15g
水加至.1000mL pH6.8±0.2
A1.2 製法
番茄汁的製作：將新鮮番茄洗淨，切碎(切勿搗碎)，放入三角燒瓶，置4℃冰箱8～12h，取出後用紗布過濾即成。如一次使用不完，可將其置入0℃冰箱，可保存四個月。使用時讓其在常溫下自然溶解。
製法：將所有成分加入蒸餾水中，加熱溶解，校正pH6.8±0.2。分裝燒瓶，高壓滅菌121℃ 15～20min。臨用時加熱熔化瓊脂，冷至50℃時使用。
A2 改良MC培養基
A2.1 成分
大豆蛋白腖 5g
牛肉浸膏 5g
酵母浸膏 5g
葡萄糖 20g
乳糖 20g
碳酸鈣 10g
瓊脂 15g
蒸餾水 1000mL
1%中性紅溶液 5mL
硫酸多粘菌素B(酌情而加)10萬國際單位
A2.2 製法
將前麵7種成分加入蒸餾水中，加熱溶解，校正pH6，加入中性紅溶液。分裝燒瓶，高壓滅菌121℃15～20min。臨用時加熱熔化瓊脂，冷至50℃，酌情加或不加硫酸多粘菌素B(檢樣有胖聽或開罐後有異味等懷疑有雜菌汙染時，可加多粘菌素B，混勻後使用)。
A3 0.1%美蘭牛乳培養基
新鮮脫脂牛乳 90mL
1%美蘭水溶液 10mL
A4 6.5%氯化鈉肉湯
肉浸液(PH7.6) 100mL
氯化鈉 6g
A5 pH9.6葡萄糖肉湯
普通肉湯校正pH9.6加入0.2%葡萄糖。
A6 40%膽汁肉湯
pH7.6肉浸液 60mL
葡萄糖 0.12g
牛膽汁 40mL
A7 澱粉水解培養基
PH7.6肉浸液瓊脂 90mL
羊血清 5mL
3%澱粉溶液 10mL
A7.1 將肉浸液瓊脂溶化。
A7.2 待冷至50℃左右以無菌操作加入澱粉溶液及無菌羊血清混合後，傾注平板。
A8 精氨酸水解培養基
蛋白腖 0.1g
氯化鈉 0.5g
磷酸氫二鉀 0.6g
L精氨酸 1g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL
瓊脂 0.3g
蒸餾水 100mL
pH7.2
A9 乳酸杆菌糖發酵管
A9.1 基礎成分
牛肉膏 5g
蛋白腖 5g
酵母浸膏 5g
吐溫80 0.5mL
瓊脂 1.5g
1.6%澳甲酚紫酒精溶液 1.4mL
蒸餾水 1000mL
A9.2 按0.5%加入所需糖類，並分裝小試管。
A10 七葉苷培養基
蛋白腖 5g
磷酸氫二鉀 1g
七葉苷 3g
枸櫞酸鐵 0.5g
1.6%溴甲酚紫酒精溶液 1.4mL
蒸餾水 100mL
附加說明：
本標準由衛生部衛生監督司提出。
本標準由南京市衛生防疫站、廣東省食品衛生監督檢驗所、上海市食品衛生監督檢驗所負責起草。
本標準主要起草人陳曉蔚、劉敏、楊明、宋曼丹、瞿明娟、周蓓君。
本標準由衛生部委托技術歸口單位衛生部食品衛生監督檢驗所負責解釋。
上一篇：輪狀病毒
下一篇：芽孢染色法
