微生物限度檢查法係指非規定滅菌製劑及其原、輔料受到微生物汙染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控製菌的檢查。
供試品應隨機抽樣。一般抽樣量為檢驗用量（2個以上最小包裝單位）的3倍量。
檢查的全過程,均應嚴格遵守無菌操作，嚴防再汙染。
除另有規定外，本檢查法中細菌培養溫度為30～35℃，黴菌、酵母菌培養溫度為25～28℃，控製菌培養溫度為36℃±1℃。
檢驗結果的報告以1g、1ml或10cm2為單位。
培養基及其製備方法
除另有規定外，培養基製備的滅菌條件為121℃20分鍾。
1.營養瓊脂培養基與營養肉湯培養基 見無菌檢查法（附錄Ⅺ H）。
2.玫瑰紅鈉瓊脂培養基
腖 5g 玫瑰紅鈉 0.0133g 葡萄糖 10g
瓊脂 15～20g 磷酸二氫鉀 1g 水 1000ml
硫酸鎂 0.5g
除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，混合，加熱溶化後，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝，滅菌。
3.酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基(YPD)
腖 10g 瓊脂 15～20g 酵母浸出粉 5g
水 1000ml 葡萄糖 20g
除葡萄糖外，取上述成分，混合，加熱溶化後，濾過，加入葡萄糖，分裝，滅菌。
4.膽鹽乳糖培養基(BL)
腖 20g 磷酸二氫鉀 1.3g 乳糖 5g
牛膽鹽（或去氧膽酸鈉0.5g）2g
氯化鈉 5g
水 1000ml
磷酸氫二鉀 4.0g
除乳糖、牛膽鹽外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調節pH值使滅菌後為7.4±0.2，煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽，分裝，滅菌。
5.曙紅亞甲藍瓊脂培養基(EMB)
營養瓊脂培養基 100ml
曙紅鈉指示液 2ml
20％乳糖溶液 5ml
亞甲藍指示液 1.3～1.6ml
取營養瓊脂培養基，加熱溶化後，冷至60℃，按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液，搖勻，傾注平皿。
6.麥康凱瓊脂培養基(MacC)
腖 20g 1%中性紅指示液 3ml
乳糖 10g 瓊脂 15～20g
牛膽鹽 5g 水 1000ml
氯化鈉 5g
除乳糖、指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，分裝，滅菌，冷至約60℃，傾注平皿。
7.4-甲基傘形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-Glucuronide，MUG)培養基
腖 10g 磷酸二氫鉀 0.9g 硫酸銨 5g
磷酸氫二鈉(無水) 6.2g
酸錳 0.5mg
亞硫酸鈉 40mg
硫酸鋅 0.5mg
去氧膽酸鈉 1g
硫酸鎂 0.1g
MUG 75mg
氯化鈉 10g
水 1000ml
氯化鈣 50mg
除MUG外，各成分溶解於1000ml水中，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，加入MUG，溶解後，每管分裝5ml，115℃滅菌20分鍾。
8.三糖鐵瓊脂培養基(TSI)
腖 20g 硫酸亞鐵 0.2g 牛肉浸出粉 5g
硫代硫酸鈉0.2g 乳糖 10g 硫代硫酸鈉 12.5ml
蔗糖 10g 瓊脂 12～15g 葡萄糖 1g
水 1000ml 氯化鈉 5g
除三糖、指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，分裝，滅菌，製成高底層(2～3cm)短斜麵。
9.四硫磺酸鈉亮綠培養基(TTB)
腖 5g 硫代硫酸鈉 30g 牛膽鹽 1g
水 1000ml 硫酸鈣 10g
取上述成分，混合，微溫使溶解，滅菌。
臨用前，取上述培養基，每10ml加入碘溶液(取碘6g與碘化鉀5g，溶於20ml水中)0.2ml和亮綠試液0.1ml，混勻。
10.沙門、誌賀菌屬瓊脂培養基(SS)
腖 5g 硫代硫酸鈉 8.5g 牛肉浸出粉 5g
中性紅指示液 2.5ml
乳糖 10g
亮綠試液 0.33ml
牛膽鹽 8.5g
瓊脂 20g
枸櫞酸鈉 8.5g
水 1000ml
枸櫞酸鐵銨 1g
除乳糖、指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調節pH值使滅菌後為7.2±0.1，濾過，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘各成分，搖勻，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。
11.膽鹽硫乳瓊脂培養基(DHL)
腖 20g 枸櫞酸鈉 1g 牛肉浸出粉 3g
枸櫞酸鐵銨 1g 乳糖 10g 中性紅指示液 3ml
蔗糖 10g 瓊脂 18～20g 去氧膽酸鈉 1g
水 1000ml 硫代硫酸鈉 2.3g
除糖、指示液及瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為7.2±0.1，加入瓊脂，加熱溶化後，再加入其餘成分，搖勻，冷至60℃，傾注平皿。
12.溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基
腖 10g
溴化十六烷基三甲銨 0.3g
牛肉浸出粉 3g
瓊脂 15～20g
氯化鈉 5g
水 1000ml
除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為7.5±0.1，加入瓊脂，加熱溶化後，分裝，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。
13.亞碲酸鹽肉湯培養基
臨用前，取滅菌的營養肉湯培養基，每100ml中加入新配製的1%亞碲酸鈉(鉀)試液0.2ml，混勻，即得。
14.卵黃氯化鈉瓊脂培養基
腖 6g
10%氯化鈉卵黃液 100ml
牛肉浸出粉 1.8g
瓊脂 23g
氯化鈉 30g
水 650ml
除10%氯化鈉卵黃液外，取上述成分混合，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為7.6±0.1，滅菌，待冷至約60℃，以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液，充分振搖，傾注平皿。
10%氯化鈉卵黃液的製備 取新鮮雞蛋1個，以無菌操作取出卵黃，放入10%滅菌氯化鈉溶液100ml中，充分振搖，即得。
15.甘露醇氯化鈉瓊脂培養基
腖 10g
酚磺酞指示液 2.5ml
牛肉浸出粉 1g
瓊脂 15～20g
甘露醇 10g
水 1000ml
氯化鈉 75g
除甘露醇、指示液及瓊脂外，取上述成分混合，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為7.4±0.2，加入瓊脂，加熱溶化後，濾過，分裝，滅菌，冷至60℃，傾注平皿。
16.蛋白腖水培養基
胰蛋白腖 10g
水 1000ml
氯化鈉 5g
取上述成分，混合，加熱溶化，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，分裝於小試管，滅菌。
17.磷酸鹽葡萄糖腖水培養基
腖 7g
磷酸氫二鉀 3.8g
葡萄糖 5g
水 1000ml
取上述成分，混合，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，分裝於小試管，121℃，滅菌15分鍾。
18.枸櫞酸鹽培養基
氯化鈉 5g
枸櫞酸鈉(無水) 2g
硫酸鎂 0.2g
溴麝香草酚藍指示液 20ml
磷酸氫二鉀 1.0g
瓊脂 15～20g
磷酸二氫銨 1g
水 1000ml
除指示液和瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為6.9±0.1，加入瓊脂，加熱溶化，加入指示液，混勻，分裝於小試管，滅菌，置成斜麵。
注：所用瓊脂應不含遊離糖，用前用水浸泡衝洗。
19.糖、醇發酵培養基
基礎液 腖 10g
0.5%酸性品紅指示液 10ml
糖、醇 0.5%
(或溴麝香草酚藍指示液6ml)
氯化鈉 5g
水 1000ml
取腖和氯化鈉加入水中，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為7.4，加入指示液，混勻，分裝每瓶100ml，121℃滅菌15分鍾。
配製葡萄糖發酵培養基時，於100ml基礎液加入0.5g葡萄糖，分裝於含杜氏管(Durham)的小試管中，121℃滅菌15分鍾。配製其他糖、醇發酵培養基時，將各種糖、醇分別配成10%溶液，與基礎液同時於121℃滅菌15分鍾。以無菌操作將5ml糖、醇溶液加入100ml基礎液內，分裝於滅菌小試管中。
注：糖、醇溶液亦可采用薄膜過濾法除菌。
20.脲(尿素)瓊脂培養基
腖 1g
0.2%酚磺酞指示液 6ml
葡萄糖 1g
20%無菌脲溶液 100ml
氯化鈉 5g
瓊脂 20g
磷酸二氫鉀 2g
水 1000ml
除脲和瓊脂外，取上述成分，混合，調節pH值使滅菌後為7.2±0.1，加入瓊脂，加熱溶化並分裝於錐形瓶，滅菌，冷至50～55℃，加入無菌脲溶液，混勻，分裝於滅菌試管中，置成斜麵。
21.氰化鉀培養基
腖 3g
磷酸氫二鈉 5.64g
氯化鈉 5g
氰化鉀試液 15ml
碳酸二氫鉀 0.225g
水 1000ml
除氰化鉀試液外，取上述成分，混合，調節pH值使滅菌後為7.5±0.1，滅菌，冷卻後，加入氰化鉀試液，分裝於12mm×100mm滅菌試管內，每管4ml，立即用滅菌橡膠塞塞緊，置4℃保存。同時，以不加氰化鉀試液的培養基作為對照培養基，分裝於滅菌試管中。
22.賴氨酸脫羧酶試驗培養基
腖 5g
1.6%溴甲酚紫指示液 1ml
酵母浸出粉 3g
L-賴氨酸(DL-賴氨酸) 0.5(1)g
葡萄糖 1g
水 1000ml
除賴氨酸外，取上述成分，混合，加熱溶解後，加入L-賴氨酸(DL-賴氨酸)，調節pH值使滅菌後為6.8，同時以不加賴氨酸培養基作為對照。分裝於滅菌的小試管內，每管2.5ml並滴加一層液體石蠟，121℃滅菌10分鍾。
23.綠膿菌素(pyocyanin)測定用培養基(PDP瓊脂)
腖 20g
甘油 10ml
氯化鎂(無水) 1.4g
瓊脂 18～20g
硫酸鉀 10g
水 1000ml
取腖、氯化鎂和硫酸鉀加入水中，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，加入甘油及瓊脂，加熱溶化，混勻，分裝於試管，滅菌，置成斜麵。
24.明膠培養基
腖 5g
明膠 120g
牛肉浸出粉 3g
水 1000ml
取上述成分加入水中，浸泡約20分鍾，隨時攪拌，加熱使溶解，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，分裝於小試管，滅菌。
25.硝酸鹽腖水培養基
腖 10g
亞硝酸鈉 0.5g
酵母浸出粉 3g
水 1000ml
硝酸鉀 2g
取腖和酵母浸出粉加入水中，微溫使溶解，調節pH值使滅菌後為7.3±0.1，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉溶解，混勻，分裝於含杜氏管的小試管，滅菌。
試藥牛肉浸出粉 Beef extract powder
本品為米色粉末，在水中溶解。
牛膽鹽 Ox bile salt
本品為淡黃色或黃棕色粉末，味苦而甜，具吸濕性，在水和醇中易溶。
玫瑰紅鈉(四氯四碘熒光素鈉) Rose bengal〔C20H2Cl4Na2O5=1017.6〕本品為棕紅色粉末。在水中溶解，溶液呈紫色，無熒光；在硫酸中溶解，溶液為棕色。
枸櫞酸鐵銨 Ammonium ferric citrate〔C12H22FeN3O14=488.16〕
本品為棕紅色或綠色鱗片或粉末，易潮解，見光易還原成亞鐵。在水中溶解，在醇和醚中不溶。
胰蛋白腖 Tryptone
本品為米黃色粉末，在水中溶解。
液狀石蠟 Paraffin liquid
本品為無色油狀液體。在水和醇中不溶，能與醚、苯、三氯甲烷、二硫化碳和油類相混溶。
DL-賴氨酸 DL-Lysine〔C6H14N2O2=146.19〕
本品為白色結晶，極易潮解。在水中溶解。
L-賴氨酸 L-Lysine〔C6H14N2O2=146.19〕
本品為白色針狀結晶，在空氣中易吸收二氧化碳。在水中易溶，在醇中微溶，在醚中不溶。
酸性品紅 Fuchsin acid〔C20H17N3Na2O9S3=585.54〕
本品為綠色有金屬光澤的顆粒或深紅色粉末。在水中溶解，在醇中不溶。
磷酸二氫銨 Ammonium dihydrogen phosphate〔NH4H2PO4=115.03〕
本品為無色結晶或白色結晶性粉末。在水中溶解，在乙醇中不溶。
試液二鹽酸二甲基對苯二胺試液 取二鹽酸二甲基對苯二胺0.1g，加水10ml，即得。需新鮮少量配製，於冷處避光保存，如試液變成紅褐色，不可使用。
無菌對氨基苯甲酸試液 取對氨基苯甲酸0.1g,加入含10ml水的帶塞試管中，121℃滅菌20分鍾。
亞碲酸鈉(鉀)試液 取亞碲酸鈉(鉀)0.1g，加新鮮煮沸後冷至50℃的水10ml使溶解。
玫瑰紅鈉試液 取玫瑰紅鈉試液0.1g，加水使溶解成75ml。
無菌枸櫞酸鈉-氯化鈉試液 取枸櫞酸鈉0.5g，加0.9%氯化鈉溶液10ml，121℃滅菌20分鍾。
草酸銨試液 取草酸銨1g，加水溶解使成100ml。
亮綠試液 取亮綠0.1g，加水100ml使溶解。
氫氧化鉀試液 取氫氧化鉀40g，加水溶解使成100ml。
鹽酸試液 取鹽酸8.4ml，加水稀釋成100ml。
α-萘酚乙醇試液 取α-萘酚6.0g，加無水乙醇溶解使成100ml。
氰化鉀試液 取氰化鉀0.5g，加水溶解使成100ml。
氯化三苯四氮唑試液 取氯化三苯四氮唑0.1g，加水溶解使成10ml。
靛基質試液 取對二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇(或丁醇)75ml，充分振搖，使完全溶解後，再取濃鹽酸25ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導致溶液色澤變深，或取對二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解後，取濃鹽酸20ml徐徐滴入。
稀釋劑0.9%無菌氯化鈉溶液 取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，121℃滅菌20分鍾。
無菌聚山梨酯80-氯化鈉溶液 取1ml聚山梨酯80，加0.9%氯化鈉溶液使成100ml，121℃滅菌20分鍾。
無菌磷酸鹽緩衝液(pH7.2) 取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g，加水稀釋至1000ml，121℃滅菌20分鍾。
指示液
中性紅指示液 取中性紅1.0g，研細，加95％乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。
變色範圍 pH6.8～8.0（紅→黃）。
甲基紅指示液 取甲基紅0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解後，加水至500ml，即得。
亞甲藍指示液 取亞甲藍0.5g，加水溶解使成100ml。
酚磺酞指示液 取亞甲藍0.5g，加1mol/L氫氧化鈉溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。
變色範圍 pH6.8～8.4（黃→紅）。
溴甲酚紫指示液 取溴甲酚紫1.6g，加95％乙醇溶解使成100ml。
變色範圍 pH5.2～6.8（黃→紫）。
溴麝香草酚藍指示液 取溴麝香草酚藍0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。
變色範圍 pH6.0～7.6（黃→藍）。
酸性品紅指示液 取酸性品紅0.5g，加水100ml使溶解，再逐漸加1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴均應將溶液充分搖勻後再加第2滴，直至溶液呈草黃色；於沸水內保持15分鍾，再靜置2小時，濾過，即得。
變色範圍 pH6.0～7.4(黃→紅)。
曙紅鈉指示液 取曙紅鈉2.0g，加水溶解使成100ml。
供試品的檢驗量 每批供試品檢驗量一般為10g或10ml。化學膜劑為100cm2，貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可以酌減，但口服藥品不得少於3g，外用藥品不得少於5g。
供試品須取自2個以上的包裝單位，大蜜丸、膜劑除須取自2個以上的包裝單位外，應取自4丸(片)以上樣品。
供試液的製備
按供試品的理化特性與生物學特性可采取適宜的方法製成供試液。
1.液體供試品 取供試品10ml，加入稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。油劑可加適量聚山梨酯80；氣霧劑以適宜方法使拋射劑導出後，加入適量稀釋劑，混勻，吸取相當於10g或10ml供試品，再稀釋成100ml作為供試液；合劑(係指含王漿或蜂蜜者，下同)與滴眼劑可用供試品作為供試液。
2.固體、半固體或黏稠液供試品 稱取供試品10g,置0.9％無菌氯化鈉溶液100ml中，用勻漿儀或其他適宜方法，混勻後，作為供試液。在製備過程中，必要時可加適量聚山梨酯80，並適當加溫，但不應超過45℃。
(1)非水溶性供試品 取供試品5g(5ml),加入含溶化的無菌司盤80 5g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團後，慢慢加入45℃左右的0.9%無菌氯化鈉溶液約80ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為供試液(1∶20)。
(2)不溶於水的膜劑供試品 取規定量，剪碎，加稀釋劑100ml（必要時可增加稀釋劑），浸泡，振搖，作為供試液。
(3)腸溶膠囊（片）供試品 稱取供試品10g,置含無菌磷酸鹽緩衝液(pH6.8)100ml的錐形瓶內，於45℃水浴中，保溫，振搖，使溶解，作為供試液。
3.含抑菌成分供試品 供試品如幹擾控製菌檢驗，按以下方法處理後，依法檢查。
(1)稀釋法 將供試液種入較大量的培養基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。
(2)離心沉澱集菌法 取規定量的供試液，離心(每分鍾3000轉)30分鍾，棄去上清液，留底部集菌液約2ml，再稀釋成原規定量的供試液。如有不溶性藥渣，可先離心(每分鍾500轉)5分鍾，取全部上層液，再行集菌處理。
(3)薄膜過濾法 取規定量的供試液，置稀釋劑100ml中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大於0.45μm±0.02μm微孔濾膜的過濾器內，減壓抽幹後，用稀釋劑衝洗濾膜3次，每次50～100ml，取出濾膜備檢。
(4)中和法 凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品，可用相應的試劑鈍化活性因子，中和毒性後製成供試液。
對照用菌液
控製菌檢查均應作相應已知菌的對照試驗。對照菌株為大腸杆菌〔CMCC(B) 44 102〕、沙門菌〔CMCC(B) 50 094〕、銅綠假單胞〔CMCC(B) 10 104〕及金黃色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕。
取相應菌株的營養瓊脂培養基斜麵新鮮培養物1白金耳，接種至營養肉湯培養基內，培養18～20小時後，稀釋至1∶106。對照菌的加入量為50～100個。
檢查法
1.細菌、黴菌與酵母菌計數
(1)平皿菌落計數法 取均勻供試液，進一步稀釋成1∶102、1∶103等適宜的稀釋級。
分別取連續三級10倍稀釋的供試液各1ml,置直徑約90mm的平皿中，再注入約45℃的培養基約15ml，混勻，待凝固後，倒置培養，每稀釋級應作2～3個平皿。
營養瓊脂培養基用於細菌計數，玫瑰紅鈉瓊脂培養基用於黴菌計數。在特殊情況下，前者同時點計黴菌、酵母菌菌落數，後者同時點計細菌菌落數。酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基用於酵母菌計數。合劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養基與酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基分別測定黴菌、酵母菌菌落數，合並計數。液體製劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養基同時點計黴菌菌落數及酵
母菌菌落數。
菌數測定陰性對照試驗 取供試驗用的稀釋劑各1ml，置4個無菌平皿中，分別按細菌、黴菌計數用的培養基製備平板，培養，檢查，不得長菌。
細菌培養時間為48小時，分別在24小時及48小時點計菌落數，一般以48小時菌落數為準，黴菌、酵母培養時間為72小時，分別在48小時及72小時點計菌落數，一般以72小時菌落數為準。菌落如蔓延生長成片，不宜計數。
點計後，計算各稀釋級的平均菌落數，按菌數報告規則報告菌數。
菌數報告規則 細菌宜選取平均菌落數在30～300之間的稀釋級，黴菌宜選取平均菌落數在30～100之間的稀釋級作為報告菌數計算的依據。如有1個稀釋級在30～300(30～100)之間時，將該稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告；如同時有2個稀釋級在30～300(30～100)之間時，按下式計算兩級比值。
當比值≤2時，以兩稀釋級的均值報告，當比值＞2時，以低稀釋級的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；如同時有3個稀釋級的平均菌落數均在30～300之間時，以後2個稀釋級計算級間比值報告；如各稀釋級的平均菌落數均不在30～300之間，以最接近30或300的稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告；如各稀釋級平均菌落數均在300(100)以上，按最高稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告；如各稀釋級平均菌落數均小於30時，一般按最低稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告。如當1∶10(或1∶100)稀釋級平均菌落數等於或大於原液(或1∶10)稀釋級時，應以培養基稀釋法測定，按測定結果報告菌數。
(2)培養基稀釋法 取供試液（原液或1∶10、1∶100供試液）3份，每份各1ml,分別注入5個平皿內（每皿各0.2ml）。每1個平皿傾注營養瓊脂培養基約15ml，混勻，凝固後，倒置培養，計數。每1ml注入的5個平板的菌落數之和，即為每1ml的菌落數，共得3組數據。以3份供試液菌落數的平均值乘以稀釋倍數報告。
如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數小於1時，則報告菌數為小於10個。
2.控製菌檢查 除另有規定外，取供試液10ml（相當於供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理後接種，經增菌、分離培養後，進行革蘭染色、生化試驗與血清凝集試驗等項檢查。
(1)大腸杆菌(Escherichia coli) 取膽鹽乳糖培養基3份，每份100ml,2份分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌50～100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養18～24小時（必要可延至48小時）。陰性對照應無菌生長。取上述3份的培養物各0.2ml，分別接種至5ml MUG培養基管內培養，分別於5小時與24小時時，取未接種的MUG培養基管作本底對照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽性對照管呈現熒光，MUG陽性。供試液的MUG管呈現熒光，MUG陽性；無熒光，MUG陰性。然後加數滴
靛基質試液於MUG管內，液麵呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。
當陰性對照呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養基培養液澄明，並證明無菌生長，判未檢出大腸杆菌。供試液MUG陽性，靛基質陽性，判檢出大腸杆菌；MUG陰性，靛基質陰性，判未檢出大腸杆菌。
如MUG陽性、靛基質陰性，或MUG陰性、靛基質陽性，均應取供試液膽鹽乳糖培養基培養物劃線於曙紅亞甲藍瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養18～24小時，如上述供試液培養物的分離平板無菌落生長，判未檢出大腸杆菌。或有菌落生長，應挑選2～3可疑菌落作靛基質試驗(I)、甲基紅試驗(M)、乙酰甲基甲醇生成試驗(V-P)、枸櫞酸鹽利用試驗(C)及革蘭染色、鏡檢，按表1規定判斷結果。
靛基質試驗(I) 取可疑菌落或斜麵培養物，接種於蛋白腖水培養基中，培養24小時，沿管壁加入靛基質試液數滴，液麵呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。
甲基紅試驗(M) 取可疑菌落或斜麵培養物，接種於磷酸鹽葡萄糖腖水培養基中，培養48小時±2小時，於管內加入甲基紅指示液數滴，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。
乙酰甲基甲醇生成試驗(V-P) 取可疑菌落或斜麵培養物，接種於磷酸鹽葡萄糖腖水培養基中，培養48小時±2小時，於每2ml培養液中加入α-萘酚乙醇試液1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml，充分振搖，在4小時內出現紅色為陽性，無紅色反應為陰性。
枸櫞酸鹽利用試驗(C) 取可疑菌落或斜麵培養物，接種於枸櫞酸鹽培養基的斜麵上，一般培養48～72小時，培養基斜麵有菌落生長，培養基由綠色變為藍色時為陽性，培養基顏色無改變為陰性。
結果判斷見表1。對與MUG-Ⅰ反應不符的可疑菌株(見注①、②)，應重新分離培養，再作生化試驗證實。
表 1 MUG的結果判斷
MUG-Ⅰ 曙紅亞甲藍瓊脂 IMVic 結果
+ + 檢出大腸杆菌
- - 未檢出大腸杆菌
+ - 無菌生長 未檢出大腸杆菌
+ - 有菌生長 -+--① 檢出大腸杆菌③
- + 有菌生長 ++--② 檢出大腸杆菌③
注：①、②如①出現++--或②出現-+--，均應重新分離菌株，再作MUG-Ⅰ和IMVic試驗。③革蘭陰性杆菌。
(2)沙門菌(Salmonella apecies) 取營養肉湯培養基3份，每份100ml，2份分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌液作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養18～24小時，陰性對照應無菌生長。取其餘2份培養物各1ml，分別接種於四硫磺酸鈉亮綠培養基10ml中，培養18～24小時。分別劃線接種於膽鹽硫乳瓊脂(或沙門、誌賀菌屬瓊脂)培養基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞甲藍瓊脂)培養基的平板上，培養18～24小時或延至40～48小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時，供試品的平板無菌落生長，或有菌落但不同於表2所列特征時，可判為未檢出沙門菌。
如供試品平板生長的菌落特征有與表2所列菌落形態特征相符或疑似者，均應挑選2～3個菌落分別接種於三糖鐵瓊脂培養基斜麵上，陽性對照同時接種該培養基，培養18～24小時後，陽性對照的斜麵應為紅色，底層為黃色，硫化氫陽性，而供試品的疑似菌斜麵未見紅色、底層未見黃色，可判為未檢出沙門菌。否則，應繼續做以下試驗。
表 2 沙門菌菌落形態特征
培 養 基 菌 落 形 態
膽鹽硫乳瓊脂 無色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或
全部黑色或無黑色
沙門、誌賀菌屬瓊脂 無色至淡紅色，半透明或不透明，菌落中心
有時帶黑褐色
曙紅亞甲藍瓊脂 無色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤的
圓形菌落
麥康凱瓊脂 無色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心
有時為暗色
靛基質試驗 照大腸杆菌項下操作並判斷結果。
脲酶試驗 取疑似菌斜麵培養物接種於脲瓊脂培養基斜麵，培養24小時，斜麵變為紅色為陽性，不變色為陰性。
氰化鉀試驗 取培養20～24小時的疑似菌株營養肉湯培養液，分別用白金耳沾取1環，接種至對照培養基及氰化鉀培養基，立即以橡膠塞塞緊，培養24～48小時，對照管應有菌生長，試驗管有菌生長者為陽性，無菌生長為陰性。
賴氨酸脫羧酶試驗 取疑似菌斜麵培養物分別接種於賴氨酸脫羧酶培養基及對照培養基，培養24～48小時，對照管應為黃色，試驗管呈紫色為陽性，呈黃色為陰性。
動力檢查 取疑似菌斜麵培養物穿刺接種於半固體營養瓊脂培養基中，培養24小時，細菌沿穿刺外周擴散生長，為動力陽性，否則為陰性。陰性培養物，應在室溫保留2～3天後，再判斷。
血清凝集試驗 在潔淨載玻片一端，以白金耳沾取沙門菌屬A～F“0”多價血清2～3環，再取斜麵上部的培養物少許，與血清混合，將玻片前後側動，如出現凝集現象，應以0.9%氯化鈉溶液與同株培養物作對照試驗，無凝集現象時判為血清凝集陽性。時有反應遲緩，需將玻片與濕棉球置平皿內，約過20分鍾，再觀察。仍未出現凝集時，應取斜麵培養物，置含少量0.9%氯化鈉溶液的試管中，製成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30分鍾，待
冷，再作凝集試驗。如出現凝集，應判為陽性，否則為陰性。
上述各項試驗反應，一般應為硫化氫陽性(或陰性)，靛基質陰性，脲酶陰性，氰化鉀陰性，賴氨酸脫羧酶陽性，動力陽性，A～F“0”多價血清凝集試驗陽性。各鑒定結果按表3判定。
表 3 沙門菌檢查結果判定
序 號 血清凝集試驗（A-F“0”血清） 生化試驗 結 果
凝集反應 100℃30分鍾 0.9%氯化鈉
凝集反應 溶液對照
1 陽性 陰性 符合 檢出沙門菌
2 陰性 陽性 陰性 符合 檢出沙門菌
3 陰性 陰性 不符合 未檢出沙門菌
上述各項試驗任何一項不符合或有可疑反應的培養物，均應進一步鑒定後作出結論。
(3)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 取膽鹽乳糖培養基3份，每份100ml，2份分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌液作為陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養18～24小時，陰性對照應無菌生長，其餘2份培養液劃線接種於溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，培養18～24小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時，供試品的平板無菌落或無疑似菌落生長，可判未檢出銅綠假單胞菌。
銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表麵濕潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。如生長菌落具有上述特征或疑似者，應挑選2～3個菌落，分別接種於營養瓊脂培養基斜麵上，培養18～24小時，取培養物革蘭染色，並做氧化酶試驗。
氧化酶試驗 取潔淨濾紙片置於平皿內，用無菌玻璃棒取營養瓊脂培養基斜麵培養物塗於濾紙片上，再滴加新配製的1％二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內呈粉紅色逐漸變為紫紅色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。
如證實為非革蘭陰性無芽孢杆菌或氧化酶試驗陰性，均可判為未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。
綠膿菌素(Pyocyanin)試驗 取上述瓊脂培養物，接種於綠膿菌素測定用培養基斜麵上，培養24小時後，在試管內加氯仿3～5ml，攪碎培養基並充分振搖。靜置片刻，將氯仿移至另一試管中，加入1mol/L鹽酸試液約1ml,振搖後，靜置片刻，如在鹽酸溶液層內出現粉紅色，即為綠膿菌素陽性。試驗同時應作陰性對照。
當陰性對照試驗呈陰性時，並為革蘭陰性杆菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素陽性，可判檢出銅綠假單胞菌。
綠膿菌素陰性的培養物，應繼續做以下試驗。
硝酸鹽還原產氣試驗 取營養瓊脂培養基斜麵培養物，接種於硝酸鹽腖水培養基中，培養24小時，如在培養基的杜氏管中有氣體產生，即為陽性。
42℃生長試驗 取營養瓊脂培養基斜麵培養物於0.9％無菌氯化鈉溶液中，製成菌懸液，再將菌懸液接種於營養瓊脂培養基斜麵，立即置41℃±1℃水浴中培養24～48小時，有菌苔生長者為陽性，否則為陰性。
明膠液化試驗 以接種針沾取營養瓊脂培養基斜麵培養物，穿刺於明膠培養基內，培養24小時，取出置冰箱內10～30分鍾。如培養基仍呈溶液狀，為陽性。
當為革蘭陰性杆菌、氧化酶試驗陽性、綠膿菌素試驗陰性，其硝酸鹽還原產氣試驗、42℃生長試驗及明膠液化試驗均為陽性時，應判檢出銅綠假單胞菌。
(4)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 取亞碲酸鈉肉湯（或營養肉湯）培養基3份，每份100ml,2份分別加入規定量的供試液，其中1份加入對照菌液作為陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。均培養18～24小時（必要時可延至48小時）。
陰性對照應無菌生長。取其餘2份培養液劃線接種於卵黃高鹽瓊脂培養基平板或甘露醇高鹽瓊脂培養基平板，培養24～72小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時，供試品的平板如無菌落生長，或有菌落但不同於表4所列特征，可判未檢出金黃色葡萄球菌。
表 4 金黃色葡萄球菌菌落形態特征
培養基 菌落形態
卵黃高鹽瓊脂 金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有卵
磷脂分解的乳濁圈，菌落直徑1-2mm
甘露醇高鹽瓊脂 金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，外圍有黃
色環，菌落直徑0.7-1mm
如有菌落生長並與表4所列特征相符或疑似時，應挑選2～3個菌落，分別接種於營養瓊脂培養基斜麵上，培養18～24小時，取其培養物革蘭染色，並作血漿凝固酶試驗。
血漿凝固酶試驗 取滅菌小試管3支，各加入血漿-無菌水(1∶1)0.5ml，1支加入被檢菌株的營養肉湯培養液（或濃菌懸液）0.5ml,1支加入金黃色葡萄球菌的營養肉湯培養液或菌懸液0.5ml作陽性對照，另1支加入營養肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對照。將3管同時培養。3小時後開始檢查，以後適當時間逐次觀察直至24小時。陰性對照管的血漿流動自如，陽性對照管血漿凝固，試驗管血漿凝固者為陽性；陽性對照管和陰性對照管任何一管不符合要求時，應另製備血漿，重新試驗。
當陰性對照和陽性對照符合要求，供試品的菌株為革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗陽性時，判定為檢出金黃色葡萄球菌。
結果判斷
細菌菌落數、黴菌（酵母菌）菌落數、控製菌三項均符合該品種微生物限度項下規定，應判供試品合格；其中任何一項不符合該品種項下規定，應判供試品不合格。
細菌菌落數、黴菌（酵母菌）菌落數第一次測定超過該品種微生物限度項下規定時，應從同一批號樣品中隨機抽樣，複試2次，如3次結果平均值報告。
眼科用藥的黴菌和酵母菌菌落數複試報告，須以2次複試結果均不得長菌，方可判供試品合格。
如營養瓊脂培養基平板生長黴菌（酵母菌）菌落數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基平板生長細菌菌落數超過該品種微生物限度項下規定時，經複試2次，如3次結果平均值仍超過規定，應判供試品不合格。
各類製劑檢出控製菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再抽樣複試，即應判該供試品不合格。
表 5 微生物限度標準(單位：個/g或個/ml)
編號 劑 型 細菌數 黴菌、 大腸杆菌 銅綠假單胞菌
酵母菌數 金黃色葡萄球菌
1 片劑 1000 100
2 酊劑 100 100
3 栓劑 100 10
4 膠囊劑 1000 100
5 軟膏劑 100 100
6一般眼膏劑 100
7一般滴眼劑 100
8丸劑（滴丸、
糖丸等） 1000 100
9 氣霧劑 100 10
10 糖漿劑 100 100
11 膜劑 100/10cm2 100/10cm2
12 顆粒劑 1000 100
13口服溶液
劑、混懸劑
、乳劑 100 100
14 散劑 1000 100
外用散劑 100 100
15 滴耳劑 100 10
16 滴鼻劑 100 10
17 洗劑 100 100
18 搽劑 100 100
19 凝膠劑 100 100
注：“—”為每1g或每1ml中不得檢出。
說明：
1.含動物組織來源的製劑(包括提取物)，還不得檢出沙門菌。
2.抗細菌的口服抗生素製劑應檢查黴菌，每1g中不得過100個；抗真菌的口服抗生素製劑應檢查細菌，每1g中不得過100個。
3.黴變、長蟎者，以不合格論。
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