（一）形態與染色
典型的結核分枝杆菌形態細長，稍有彎曲，兩端呈圓形，長約1—4um，寬約0.4um，散在，有時呈索狀或短鏈狀排列，有時可見分枝狀。在陳舊培養物中或在抗結核藥物作用下可出現球狀、顆粒狀等多形性。無芽孢、無莢膜、無鞭毛。在結核性膿腫和痰等標本中，有時可見非抗酸性革蘭陽性顆粒，過去稱莫赫顆粒。該顆粒在體內或細胞培養物中能返回為典型的結核分枝杆菌，故稱為L型。在溶菌酶、青黴素和某些抗結核藥物的作用下，均可導致其變為L型呈絲狀或顆粒狀。
結核分枝杆菌革蘭染色陽性，但不易著色。經苯胺染料著色後，能抵抗酸和鹽酸乙醇脫色，此種特性稱為抗酸性。齊尼染色法為最常用的一種抗酸染色方法，經此法染色後，結核分枝杆菌呈紅色，而標本中其他細菌、細胞、雜質等均呈藍色。
（二）培養特性
為專性需氧菌，營養要求較高。初次培養常用羅氏培養基，內含血清、蛋黃、甘油、馬鈴薯、天門冬素（屬氨基酸類物質）、無機鹽類 以及孔雀綠等。孔雀綠可抑製雜菌生長，便於分離和長期培養。蛋黃含脂質生長因子，能刺激生長。最適pH6.5—6.8，溫度37—37.5℃。因結核分枝杆菌細胞壁的脂質含量較高，影響營養物質的吸收，故生長繁殖緩慢，一般繁殖一代需18h左右，接種後培養3—4周才出現肉眼可見乳酪色或米黃色、幹燥、表麵粗糙呈顆粒狀、結節或菜花狀菌落。在液體培養基中呈粗糙皺紋狀菌膜生長，若在液體培養基內加入水溶性脂肪酸，如吐溫-80，可降低結核分枝杆菌表麵的疏水性，細菌呈均勻分散生長，有利於做藥物敏感試驗等。
（三）生化反應
不發酵糖類，中性紅試驗陽性，觸酶試驗陽性，耐熱觸酶試驗為陰性。人型與牛型結核分枝杆菌的區別在於人型能合成煙酸，還原硝酸鹽，而牛型則否。另牛型結核分枝杆菌觸酶試驗、耐熱觸酶試驗均為陽性。
（四）抵抗力
因細胞壁含大量類脂質，尤其是蠟樣物質，具有疏水性，所以結核分枝杆菌對理化因素的抵抗力較一般致病菌強。在幹燥痰中能存活半年以上，附著於灰塵，飄浮在空氣中可保持傳染性8—10d，在-6∽8能存活45年；在6%H2SO4或3%HCL、4%NaOH溶液中30min內其活力可以不受影響，故常用酸堿處理有雜菌汙染的標本，以此分離結核分枝杆菌；該菌對1：13000孔雀綠和1：75000甲紫有抵抗力，故在培養基中加入上述染料可抑製雜菌生長。但濕熱（62—63℃、15min）、紫外線（日光照射2—7h）、乙醇（75%乙醇2min）可將該菌殺死，故結核病人的衣物，寢具等應常在日光下消毒。對鏈黴素、異煙肼、利福平、環絲氨酸、乙胺丁醇、卡那黴素、對氨基水楊酸等抗結核藥物敏感，但長期用藥易出現耐藥性。
（五）變異性
結核分枝杆菌在環境變化或藥物作用時容易發生形態、菌落、毒力及耐藥性等變異。
卡介苗就是毒力變異株。是將有毒的牛型結核分枝杆菌培養於含甘油、膽汁、馬鈴薯的培養基 中，經13年230次傳代而獲得 的減毒活菌株，現廣泛用於人類結核病的預防。
結核分枝杆菌對利福平、異煙肼、鏈黴素等藥物較易產生耐藥性。其耐藥機製的研究已深入到分子水平。已確定耐藥與相關基因突變密切相關：如利福平的耐藥基因為RNA聚合酶p亞單位基因（rPO基因）；異煙肼的耐藥基因為過氧化氫酶一過氧化物酶基因和靶蛋白基因。研究認為，結核分枝杆菌多重耐藥性的分子機製是各相應基因突變後積累造成的。
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