結核病的症狀和體征往往不典型，雖可借助X線攝片診斷，但確診仍有賴於細菌學檢查。
1、標本根據感染部位而定。如肺結核采取咳痰（最好取早晨第一次咳痰，挑取帶血痰或膿痰）；腎或膀胱結核以無菌導尿或取中段尿液；腸結核取糞便；結核性腦膜炎取腦脊液（CSF）；膿胸、胸膜炎、腹膜炎或骨髓結核等則穿刺取膿汁或分泌物。待檢標本一般應先集菌後檢查。痰、支氣管灌洗液、尿、糞等汙染標本需經4%NaOH（痰和堿的比例為1：4，尿、支氣管灌洗液和堿的比例為1：1）處理5min。處理後的材料再離心沉澱，取沉澱物做塗片染色鏡檢。若需進一步做培養或動物接種，應先用酸中和後再離心沉澱。
2、直接塗片鏡檢標本直接塗片或集菌後塗片，用抗酸染色。若找到抗酸陽性菌即可初步診斷。為加強染色，可將標本用苯酚複紅染色過夜，用0.5%(鹽酸乙醇脫色30s，包括大多數結核分枝杆菌L型也可著色。為提高鏡檢敏感性，也可用金胺染色，在熒光顯微鏡下結核分枝杆菌呈現金黃色熒光。
3、分離培養將集菌並經中和後的標本接種於Lowenstein培養基37℃培養，每周觀察生長情況，通常2—4周長出肉眼可見的粗糙型菌落。根據細菌的生長速度、菌落特征、產生色素情況以及抗酸性染色強弱的程度等特征做出判斷。由於抗結核藥物的使用，患者標本中常分離出結核分枝杆菌L型，故多次檢出L型亦可作為結核病活動的判斷標準之一。痰培養比塗片敏感，少至10個/ml的結核分枝杆菌也可被檢出。通常情況下，培養的敏感性為80%—85%，特異性大約在98%。
4、動物試驗常用豚鼠或地鼠鑒別疑似結核分枝杆菌的分離培養物和進行毒力測定。取經濃縮集菌處理的樣本1.0ml注射於豚鼠或地鼠腹股溝皮下，經3—4周飼養觀察，如出現局部淋巴結腫大，消瘦或結核菌素試驗陽性，可及時剖檢，並做塗片或分離培養。
5、快速診斷一般塗片檢查菌數需5000—50000/ml，培養需100/ml，標本中菌數少於此數時不易獲得陽性結果，且培養需時較長。而目前用於結核病早期和快速診斷的PCR方法，對菌量少，或細菌發生L型變異而不易培養成功的標本，其敏感性在75%—88%，特異性高達100%。PCR技術能特異性地擴增結核分枝杆菌核酸片段達到鑒定結核分枝杆菌的目的，並在1—2d內可獲陽性結果，但PCR過程中應注意汙染等問題，防止出現假陽性或假陰性結果。此外，可用ELISA法檢查結核分枝杆菌抗體；也可使用BACTEC法，以含“C棕櫚酸做碳源底物的H。Z培養基，測量在細菌代謝過程中所產生的14C量推算出標本中是否有抗酸杆菌，5—7d就可出報告；芯片技術可用於結核分枝杆菌耐藥性的檢測。
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