主題內容與適用範圍
本標準規定了蠟樣芽胞杆菌的檢驗方法。
本標準適用於食品和食物中毒樣品中蠟樣芽胞杆菌的檢驗。
2 引用標準
GB 4789.2 食品衛生微生物學檢驗 菌落總數測定
GB 4789.28 食品衛生微生物學檢驗 染色法、培養基和試劑
3 設備和材料
3．1 溫箱：36±1℃。
3．2 普能冰箱。
3．3 顯微鏡。
3．4 恒溫水浴46±1℃。
3．5 天平。
3．6 電爐。
3．7 吸管：1 mL，10 mL。
3．8 載玻片。
3．9 均質器或乳缽。
3．10 L 型塗布棒。
3．11 滅菌刀，剪，鑷子。
3．12 三角瓶：容量 500 mL。
4 培養基和試劑
4．1 肉浸液肉湯培養基：GB 4789.28 中4.1。
4．2 酪蛋白瓊脂培養基：GB 4789.28 中4.65。
4．3 動力-硝酸鹽培養基：GB 4789.28 中4.72。
4．4 緩衝葡萄糖蛋白腖水：GB 4789.28 中3.4。
4．5 血瓊脂培養基：GB 4789.28 中4.6。
4．6 3%過氧化氫溶液。
4．7 甲萘胺-乙酸溶液。
4．8 對氨基苯碘酸-乙酸溶液。
4．9 革蘭氏染色液：GB 4789.28 中2.2。
4．10 甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂培養基：GB 4789.28 中4.64。
4．11 0.5%堿性複紅染色液：GB 4789.28 中2.8。
4．12 木糖-明膠培養基：GB 4789.28 中4.66。
5 操作步驟
6 操作步驟
6．1 菌數測定
以無菌操作將檢樣 25 g（mL）（按 GB 4789.2 測定），用滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩衝液做成 10（-1） ～10（-5） 的稀釋液。取各稀釋液 0.1 mL，接種在兩個選擇性培
養基——甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂培養基上，用L 形棒塗布於整個表麵，置 36±1℃溫箱培養基 12～20 h 後選取適當菌落數的平板進行計數，蠟樣芽胞杆菌在此培養基上的菌落為粉紅色（表示不發酵甘露醇）周圍有粉紅色的暈（表示產生卵磷脂酶）。計算後，從中挑取 5 個此種菌落做證實試驗。根據證實為蠟樣芽胞杆菌的菌落數計算出該平板上的菌落數，然後乘其稀釋倍數，即得每克（或毫升）樣品中含蠟樣芽胞杆菌數，例如 MYP 平板的可疑菌落數為25個，取5個鑒定，證實為4個，乘上稀釋倍數（如10），再乘上 1 g（或 mL）檢樣數（取的是0.1 mL 樣）則為：
25×4/5×10（4） ×10=2×10（6）
6．2 分離培養
取檢樣或稀釋液劃線分離培養於選擇性培養基（MYP）上，置37℃培養12～20 h，挑取可疑的蠟樣芽胞杆菌菌落（見6.1）接種於肉湯和營養瓊脂做成純培養，然後做證實試驗。
6．3 證實試驗
6．3．1 形態觀察
本菌為革蘭氏陽性大杆菌，寬度在 1μm或1μm以上，芽胞呈卵圓形，不突出菌體，多位於菌體中央或稍偏於一端。
6．3．2 培養特性
本菌在肉湯中生長混濁，常微有菌膜或壁環，振搖易乳化；在普通瓊脂平板上生成的菌落不透明、表麵粗糙、似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣不齊。
6．3．3 生化性狀及生化分型
6．3．3．1 生化性狀
本菌有動力；能產生卵磷脂酶和酪蛋白酶；過氧化氫酶試驗陽性；溶血；不發酵甘露醇和木糖；常能液化明膠和使硝酸鹽還原；在厭氧條件下能發酵葡萄糖。
6．3．3．2 生化分型
蠟樣芽胞杆菌可根據對檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、澱粉水解、V-P反應、明膠液化性狀的試驗，將該菌分成不同的型別。
表 1 蠟樣芽胞杆菌生化分型
生化試驗
型別
檸檬酸鹽利用 硝酸鹽還原 澱粉水解 V-P 反應 明膠液化
1 + + + + +
2 - + + + +
3 + + - + +
4 - - + + +
5 - - - + +
6 + - + + +
7 + - - + +
8 - + - + +
9 - + - - +
10 - + + - +
11 + + + - +
12 + + - - +
13 - - + - -
14 + - - - +
15 + - + - +
表 2 蠟樣芽胞杆菌與其他類似菌的鑒別
項目 巨大芽胞杆菌 蠟樣牙胞杆菌 蘇雲金芽胞菌 蕈狀芽胞杆菌 炭疽芽胞杆
過氧化氫酶 + + + + +
動力 ± ± ± - -
硝酸鹽還原 - + + + +
酪蛋白分解 ± + ± ± ±
卵黃反應 - + + + +
葡萄糖利用厭氧 - + + + +
甘露醇 + - - - -
木糖 ± - - - -
溶血 - + + ± ±
已知致病菌特性 產生腸毒素 對昆蟲致病的內毒素結晶 假根樣生長 對動物和人致病
注：+90%～100%的菌株陽性；-90%～100%的菌株陰性；±大多數菌株陽性；-（+）大多數菌株陰性。
本菌在生化性狀上與蘇雲菌芽胞杆菌極為相似，但後者可籍細胞內產生蛋白質毒素結晶加以鑒別。其檢查方法如下：取營養瓊脂上純培養物少許，加少量蒸餾水塗於玻片上，待自然幹燥後用弱火焰固定，加甲醇於玻片上，半分鍾後傾去甲醇，置火焰上幹燥，然後滴加 0.5%堿性複紅液，並用酒精燈加熱至微見蒸氣維持 1.5 min，移去酒精燈，將玻片放置半分鍾，傾去染液，置潔淨自來水充分漂洗，晾幹，鏡檢，在油浸鏡下檢查有無遊離芽胞和深染的似菱形的紅色結晶小體（如未形成遊離芽胞，培養物應放室溫再保存 1～2 d後再檢查），如有即為蘇雲金芽胞杆菌，蠟樣芽胞杆菌檢查為陰性。
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