5 樣品處理
5.1 鬃、毛、絨、生骨粒
5.1.1 根據樣品多少將適當數量的同批樣品(最多不超過 10份)合編為一個檢驗樣品單位,作好記錄。
5.1.2 從合編為一個檢驗樣品單位的每個樣品袋中各取 1～2g樣品,一起放入一個適當大小的滅菌三角燒瓶中。
5.1.3 加樣品量 30～40倍(W/V)的預冷洗樣液於三角燒瓶,用滅菌膠塞將瓶口塞嚴。
5.1.4 將三角燒瓶放入冰水浴或 0～4℃冰箱內,間或搖動約 1h。
5.1.5 將瓶中洗樣液倒入 500mL滅菌離心管內,蓋住管口,以3000r/min離心20min。
5.1.6 棄去上清液(注意防止汙染),加少許滅菌水,使沉澱均勻懸浮。
5.1.7 將離心管靜置 5～10min,待雜質下沉後,將上懸液移入另一支滅菌試管內,於65℃恒溫水浴加熱 30 min。
5.1.8 加洗樣液後的樣品於熱處理前如不能及時檢驗,應貯於0～4℃冰箱內,以防芽胞發芽。
5.2 動物毛皮如不立即檢驗,將棉拭子放於0～4℃冰箱內。
6 檢驗方法
6.1 分離培養
6.1.1 鬃、毛、絨、生骨粒
6.1.1.1 根據每管所包括樣品份數之多少,各接種 1～3個溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌素平板。接種時,用滅菌吸管吸取樣液,滴加於平板表麵,各0.1～0.3mL。如有剩餘樣品,可增接數個平板,直至將樣品接種完。
6.1.1.2 用滅菌 L形玻璃棒將滴加的樣液塗布均勻。如樣液較多,可將平板置於36±1℃溫箱,微開皿蓋,使樣液迅速幹燥。
6.1.1.3 翻轉平皿,置於36±1℃恒溫箱,培養 24～48h。
6.1.2 動物毛皮
6.1.2.1 將棉拭子由試管內取出,各塗抹一個溶菌酶多粘菌素平板或戊烷脒多粘菌平板。6.1.2.2 翻轉平皿,置於36± 1℃恒溫箱,培養 24～48 h。
6.2 菌落及菌形觀察
6.2.1 將培養的平板取出,用肉眼,必要時借助放大鏡觀察有無典型炭疽杆菌菌落。炭疽杆菌菌落扁平、暗灰色、不透明、無光澤、表麵粗糙、邊緣不整齊。用放大鏡觀察,邊緣呈卷發狀,用接種針探觸,有粘滯感,挑之,可拉起絲。
6.2.2 從典型或可疑菌落取培養物製備塗膜,經革蘭氏染色,鏡檢。炭疽杆菌被染成藍紫色,由多個菌縱連成長鏈。少數單個菌呈大杆狀,兩端平齊。有的菌體中央可見卵圓形不著色的芽胞。芽胞不使菌體膨大。
6.3 肉湯培養特性觀察取菌落和菌形均似炭疽杆菌的培養物,接種肉湯管,於 36±1℃恒溫箱培養 5～12h,觀察細菌生長情況。炭疽杆菌在肉湯中生長初期的特征是：肉湯上部澄清,無菌膜,下部有絮狀沉澱,沉澱不易搖散。
6.4 確定試驗
6.4.1 大豆凝集素吸收試驗
6.4.1.1 方法
a. 加大豆凝集素稀釋液(A11)一滴於比色板或載玻片上。
b. 用接種環取一滿環可疑菌落,研混於大豆凝集素稀釋液內成濃厚菌液,持續攪拌2～3min。
c. 加一滴 5％兔血球懸液,攪勻,前後傾動玻片 3～5min,觀察血球是否凝集。
6.4.1.2 判定
＋＋＋＋：血球凝集成塊狀,均勻散布,液體無色。
＋＋＋：血球凝集成大顆粒,均勻散布,液體無色。
＋＋：血球凝集成顆粒,均勻散布,液體無色。
＋：血球凝集成細小顆粒,均勻散布,液體無色。
±：血球凝集成細微顆粒,均勻散布,液體呈不顯著黃紅色。
－：血球不凝集,搖動後匯集於中央,呈淡黃紅色,液體呈不顯著黃紅色。
注：“＋＋＋”～“＋”為陽性。“±”為可疑。“－”為陰性。
6.4.2 噬菌體裂解試驗
6.4.2.1 方法
a. 用營養瓊脂平板的皿底外麵畫三個直徑約 30mm ,相隔約 20mm為圓圈。
b. 用接種環取可疑炭疽杆菌的新鮮肉湯培養物塗滿與兩個圓圈相對應的瓊脂表麵。另取已知炭疽杆菌的新鮮肉湯培養物,塗滿與第三個圓圈相對應的瓊脂表麵,作上區分的標記。
c. 待菌液被吸幹後,在接種被檢菌的圓圈內,一個加一滴無菌肉湯,另一個加一滴炭疽杆菌噬菌體。在接種已知炭疽杆菌的圓圈內,加一滴炭疽杆菌噬菌體。
d. 將平皿放入36±1℃ 恒溫箱(隔架麵要平,以防噬菌體液流散),微開皿蓋,使液體迅速幹燥。然後翻轉平皿,培養12～18h。
6.4.2.2 判定
a. 加噬菌體的兩個圓圈內都出現蝕斑,加肉湯的圓圈內無蝕斑,為陽性反應。
b. 加已知炭疽杆菌的圓圈內出現蝕斑,加被檢菌的兩個圓圈內無蝕斑,為陰性反應。
c. 三個圓圈內都無蝕斑,表明噬菌體已失效,應另換有效噬菌體進行試驗。
6.4.3 串珠試驗
6.4.3.1 方法
a. 取適量 4～12h可疑炭疽杆菌肉湯培養物,接種於 1.8mL肉湯管內(製備濕片在低倍顯微鏡下檢查,每個視野應含菌鏈 5～10條)。
b. 加 5IU/mL青黴素 0.2mL,使青黴素最終濃度為 0.5IU/mL 。
C. 於 37℃水浴培養 1～2h ,取出,加入 20％ 福爾馬林 0.25 mL,固定 10 min。
d. 製備濕片,在顯微鏡下檢查。
6.4.3. 判定
＋＋＋＋：菌體大而圓,均勻,排列整齊；
＋＋＋：菌體圓,均勻,排列整齊；
＋＋：菌體橢圓,排列整齊；
＋：菌體均勻腫大,變粗；
±：菌體大小不一,不圓,排列不整齊；
－：菌體形態無變化。
注：“＋＋＋＋”～“＋”為陽性。“±”為可疑。“－”為陰性。6.4.4 動物試驗6.4.4.1 取可疑炭疽杆菌的肉湯培養物,用生理鹽水稀釋為 10 000個菌/mL(微混濁),接種 2～3隻小白鼠。一隻於皮下注射 0.1mL；其餘每隻於腹腔注射 0.2mL。
6.4.4.2 如小白鼠死亡(通常於1～3d內),立即進行剖檢,觀察有無炭疽病理變化(如皮下膠樣水腫,脾髒腫大,血凝不良),製備數張血液和腹水塗片,供做菌形檢查,同時取病變材料或體液接種數管肉湯,以備核查。
6.4.5 染色鏡檢
6.4.5.1 染色液的配製
A液：美藍 0.3g乙醇(95％) 30.0mL
B液：0.01％氫氧化鉀溶液 100mL將 A、B兩液混合而成。
6.4.5.2 染色方法
a. 將被檢材料的塗片浸入固定液內 15～20 min；
b. 滴加染色液浸沒塗膜,染色 1～2 min；
c. 用水衝去染色液,自然幹燥或用吸墨紙吸幹水分；
d. 鏡檢。
6.4.5.3 判定炭疽菌菌體呈藍色,粗大杆狀,兩端平齊,相連成短鏈或成對,菌體周圍以淡藍紫色莢膜。
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