7 證實試驗
7.1 形態觀察取營養瓊脂斜麵培養物,作革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽孢杆菌為革蘭氏陽性大杆菌,呈短鏈或長鏈,芽孢呈橢圓形位於菌體中央或偏端,不使菌體脹大。
7.2 生化學性狀
7.2.1 葡萄糖發酵試驗
接種於酚紅葡萄糖肉湯中,厭氧條件下35℃培養24h。培養基應由紅色變為黃色(表明本菌在厭氧條件下分解葡萄糖產酸)。
7.2.2 硝酸鹽還原試驗
接種於硝酸鹽肉湯中,35℃培養24h。加硝酸鹽試劑後應為陽性反應(紅色)。
7.2.3 V-P試驗
接種於改良V-P培養基中,35℃培養48 h。加V-P試劑及肌酸數粒,靜止1h,應為陽性反應(伊紅色)。
7.2.4 L-酪氨酸分解試驗
接種於L-酪氨酸瓊脂培養基上,35℃培養48 h,陽性反應菌落周圍培養基應出現澄清透明區(表示產生酪蛋白酶)。陰性時應繼續培養72 h再觀察。
7.2.5 溶菌酶試驗
用直徑2mm接種環取純菌懸液一環,接種於溶菌酶肉湯中,35℃培養24h。該菌在本培養基(含0.001％的溶菌酶)中能生長。如出現陰性反應,應繼續培養24 h。
7.2.6 卵磷脂酶試驗 接種於MYP瓊脂平板上,35℃培養24 h。陽性反應菌落周圍應出現沉澱環(表示產生卵磷脂酶)。
7.3 蠟樣芽孢杆菌與類似菌的鑒別試驗
7.3.1 動力試驗
用接種針挑取培養物穿刺接種於動力培養基中,30℃培養24h。有動力蠟樣芽孢杆菌應沿穿刺線呈擴散生長,而蕈狀芽孢杆菌常常呈絨毛狀生長,形成所謂的蜂巢狀擴散。也可用懸滴法檢查。蠟樣芽孢杆菌和蘇雲金芽孢杆菌通常運動極為活潑,而炭疽杆菌則不運動。7.3.2 根狀生長試驗
用接種環取培養物接種於營養瓊脂平板上,30℃培養18～24h。蠟樣芽孢杆菌群的多數菌株形成粗糙的似毛玻璃狀或融蠟狀的菌落。其中唯獨蕈狀芽孢杆菌則形成根狀生長的特征。
7.3.3 溶血試驗
取培養物接種於胰酪腖大豆羊血瓊脂平板上,30～32℃培養24h。蠟樣芽孢杆菌落周圍呈現β型完全溶血的溶血環。蘇雲金芽孢杆菌和蕈狀芽孢杆菌呈現弱的溶血現象,而炭疽芽孢杆菌通常為不溶血。
7.3.4 蛋白質結晶毒素試驗
取經30℃培養24h並於室溫放置2～3d的營養瓊脂培養物少許於載玻片上,滴加蒸餾水混塗成薄膜。經自然幹燥,微火固定後,於塗膜加甲醇半分鍾後傾掉,再通過火焰幹燥,於載片上滴滿0.5％堿性複紅液,放火焰上加熱微見蒸氣(勿使染液沸騰)後持續1.5min,移去火焰,使載片放置0.5min再傾去染液。用潔淨自來水徹底清洗、晾幹、鏡檢。觀察有無遊離芽孢和染成黑色的菱形毒素結晶體。如發現遊離芽孢形成的不豐富,應將培養物置室溫2～3d再行檢查。蘇雲金芽孢杆菌用此法檢測為陽性,而蠟樣芽孢杆菌群的其他菌種則為陰性。
7.3.5 結果解釋及報告
符合蠟樣芽孢杆菌群的特征,有活潑的動力,很強的溶血能力,不形成根狀生長和不產生蛋白結晶毒素,可報告為蠟樣芽孢杆菌。
對偶爾遇到的一些少數可疑菌株,可以根據需要進行其他試驗,如青黴素酶、噬菌體試驗等。
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