7.1 自分離培養基上挑取可疑菌落與O1群及O139群霍亂弧菌診斷血清做玻片凝集試驗。如可疑菌落在診斷血清中很快(一般在10s內)出現肉眼可見的明顯凝集,在生理鹽水中不凝集者判斷為陽性。
7.2 O1群多價血清陽性的霍亂弧菌可進一步用小川型、稻葉型的單價抗血清分型。
7.2..1 在小川型單價血清凝集,在稻葉型單價血清不凝集者為小川型。
7.2.2在小川型單價血清凝集,在稻葉型單價血清不凝集者為小川型。
7.2.3在小川型、稻葉型單價血清均呈明顯凝集者為彥島型。
7.3 與O1群或O139群霍亂弧菌診斷血清及生理鹽水均不凝集者為非O1群霍亂弧菌。
7.4 與O1群霍亂弧菌多價血清或O139群霍亂弧菌診斷血清及生理鹽水均凝集的,可用胰腖水大豆瓊脂或腦心浸液瓊脂傳代,再進行凝集試驗。
7.5 對玻片凝集反應不典型的菌株應做試管凝集試驗。
用生理鹽水自1:20開始對倍連續稀釋O1群霍亂弧菌多價血清,每管含稀釋血清0.5mL。將被檢菌在營養瓊脂的16h~18h培養物用0.2%甲醛生理鹽水製成每毫升約含18億菌體(相當於細菌標準比濁管濃度)的懸液,每稀釋血清管加入0.5mL;另將菌懸液0.5mL加入0.5mL生理鹽水中作為對照。搖勻,置37℃3h觀察初步結果。再放4℃或室溫過夜,觀察最後結果:生理鹽水對照不出現自然凝集,能使菌凝於管底成傘狀,上清半透明判為++;能使試驗菌出現+-凝集的血清最高稀釋倍數為凝集滴度。凝集滴度達到或超過血清原效價一半即確定為O1群霍亂弧菌。
8、古典型與埃爾托型霍亂弧菌的鑒別
8.1 多粘菌素B敏感試驗
8.1.1在胰酪腖大豆腖瓊脂平板背麵用玻璃筆劃出若幹方格。
8.1.2將被檢菌(36±1)℃4h肉湯培養物劃線平板表麵,待幹後鑷取50單位多粘菌素B紙片置於接種區中央,倒置平板,(36±1)℃培養過夜。
古典型菌株在紙片周圍呈現抑製帶(10mm~15mm直徑),而埃爾托型菌株不受抑製或輕微抑製(7mm直徑)。
8.2溶血試驗
8.2.1將24h培養物和5%紅細胞鹽水懸浮液等量混合(0.5mL或1mL)。
8.2.2將上項部分混合液在56℃加熱30min做對照。
8.2.3將混合物在(36±1)℃水溶液中培養2h,再在(4~5)℃下冷藏過夜。
8.2.4檢查溶血現象,必要時可低速離心後再檢查有無溶血現象。
多數埃爾托型菌株會造成紅血球溶解,古典型及某些埃爾托型菌株不溶解紅血球,由於溶血素不耐熱,加過熱的培養物不會產生溶血。
8.3加試劑觀察結果。
埃爾托型V-P試驗
8.3.1接種MR-VP肉湯,22℃培養18h~24h。
8.3.2滴菌株通常為陽性,古典型菌株通常為陰性。
9、報告結果
霍亂弧菌的檢出,可依據以下性狀報告:
革蘭氏染色陰性,無芽孢或彎曲杆菌;
TSI:斜麵產酸,底層產酸,不產氣,不產硫化氫(H2S);
Hugh-Leifson試驗:葡萄糖發酵陽性;
氧化酶:陽性;
精氨酸脫羧酶試驗:陰性;
賴氨酸脫羧酶試驗:陽性;
V-P試驗:埃爾托生物型陽性,古典生物型陰性;
42℃生長:陽性;
嗜鹽性試驗:0%NaCl+(有的非O1群霍亂弧菌不生長)
3%NaCl+
6%NaCl-
蔗糖發酵:陽性;
ONPG試驗:陽性;
阿拉伯糖發酵:陰性;
O129抑菌試驗:10μg敏感;150μg敏感;
血清學試驗:O1群(稻葉型、小川型、彥島型)、O139群、非O1群。
最終結果的報告,應在生化試驗的基礎上報告血清型別和生物型別。
如有明確規定,僅需檢驗O1、O139群霍亂弧菌時,可直接對可疑菌株進行血清學凝集試驗進行初步鑒定。
檢出O1、O139及非O1群霍亂弧菌的,要在24h內呈報到上一級實驗室做進一步鑒定或複查,並報告國家出入境檢驗檢疫局。
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